Please enter banners and links.
مقدمه:
افزون بر 20% از اراضی کشاورزی و نزدیک به نیمی از زمین های آبی در دنیا متأثر از مشکل شوری هستند که این، عامل محدود کننده رشد و نمو گیاهان در سراسر جهان و مشکلی جدی برای تولید محصول کشاورزی میباشد (28). شوری خاک یکی از مهمترین مشکلات محیطی است که تولید محصول زراعی را تحت تاثیر قرار میدهد (51). لذا، فهم مکانیسم های تحمل به شوری بسیار با اهمیت است (15). عملکرد گیاهان زراعی تحت تأثیر تنشهای زنده و غیر زنده بیش از 50% کاهش مییابد (146). افزایش شوری خاک یا آب موجب ایجاد اختلال در فرآیندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی گیاه شده و باعث بروز مشکلاتی مانند 1) عدم تعادل یونی 2) کمبود مواد معدنی 3) تنش اسمزی 4) سمَیَت یونی و تنش اکسیداتیو میگردد (64). این شرایط با اجزای سلولی همانند DNA، لیپیدها و رنگدانه ها اثر متقابل مییابد (134) و رشد و نموَ اکثر گیاهان زراعی را کاهش میدهد. تحمل نسبت به شوری صفتی چند ژنی است که شامل الف) تقسیم بندی مقادیر زیاد نمک در داخل گیاه ب) تنظیم اسمزی و ج) تغییرات مورفولوژیکی میباشد (84). مطالعاتی که در زمینه تحمل به تنش شوری انجام گرفته است شامل: 1- برنامه های اصلاح کلاسیک که علی رغم برخی موفقیتها، به دلیل ماهیت چند ژنی بودن این صفت محدود گردیده است، 2- استفاده از موتاسیونهایی که منجر به از بین رفتن و حذف عملکرد ژن میگردند برای شناسائی و مطالعه ژنهای مسئول تنش. برای مثال در آرابیدوپسیس، به دلیل سهولت در دستکاری ژنتیکی این گیاه (6)، تحقیقاتی در این زمینه انجام گرفته است و 3- روش های کشت آزمایشگاهی در گیاهانی مانند یونجه (154)، برنج (77 و 155) و سیب زمینی (93) میباشد. توسعه گیاهان دارای پتانسیل ژنتیکی بالقوه برای تحمل نسبت به این تنش، به کاهش استفاده از آب نیز کمک میکند (27). افزایش گیاهان متحمل (124) همراه با مهندسی ژنتیک نتایج خوبی را از نظر احتمال انتقال سریع و دقیق صفات مطلوب به داخل گیاهان مورد نظر، بدون حضور ژن های مضر از خویشاوندان نزدیک گیاه، نشان داده است (111). زیرا در این روش، از انتقال مناطق ناخواسته کروموزومی ممانعت میگردد (112 و 20). استفاده از ظرفیت داخلی گیاه، تحمل آن نسبت به این تنش را تقویت میکند و مهندسی ژنتیک مدرن به انتقال صفات مطلوب کمک مینماید (94).
جو یکی از متحملترین گیاهان زراعی است که طی سالها، از روشهای مختلف فیزیولوژیکی برای تعیین تنوع فنوتیپی تحمل به شوری در این گیاه استفاده شده است (149). ذخایر ژنی جوی زراعی در مقایسه با انواع وحشی آن تنوع ژنتیکی محدودی را نشان دادند که این امر بیانگر لزوم توسعه ارقام سازگار میباشد (105). گزارش شده است که جمعیت هایی که در مناطق تحت تنش شوری رشد مییابند دارای تنوع ژنتیکی گستردهتری هستند (88). از نظر میزان محصول دانه در محیط شور، جو یکی از اعضای متحمل به شوری در تیره تریتیاسه است (69). مکانیسم تحمل به شوری در این تیره عموماً شامل تجمع یون سدیم در طول دوره رشد گیاه میباشد (15 و 138). از نقطه نظر تجمع این یون در تیره تریتیاسه، گیاه جو دارای تنوع ژنتیکی بالایی است. شوری یکی از موانع اصلی افزایش تولید محصول در جو بوده و تحمل به این تنش در مراحل مختلف رشد گیاه متفاوت است. حساسترین مراحل رشد گیاه در مقابل تنش شوری در جو دو مرحله جوانه زنی و گیاهچگی میباشد و با افزایش سن گیاه میزان تحمل آن نیز افزایش مییابد. تأثیر این تنش در مرحله جوانه زنی جو بیشتر مربوط به اثرات یونی است (134)، در حالیکه در مرحله گیاهچگی تنش شوری حاصل اثرات اسمزی میباشد (74). بین تحمل به شوری در دو مرحله رشدی جوانهزنی و گیاهچگی هیچ رابطهای وجود ندارد (74). مکانیسمهای تحمل به شوری در جو شامل موارد زیر است: 1- انتقال یون سدیم از برگهای گیاه جو به داخل واکوئول که موجب کاهش سمَیَت این یون میشود (38) و 2- توزیع بیشتر یون پتاسیم موجود در برگهای جو به داخل سلولهای مزوفیل نسبت به توزیع آنها در سلولهای اپیدرم که موجب افزایش نسبت یونی پتاسیم به سدیم در سیتوپلاسم سلولهای مزوفیل میشود و این وضعیت برای ثبات فتوسنتز با اهمیت است (56).
استراتژیهای حفاظت در مقابل آسیب ناشی از شوری در جو عبارت از استراتژی های فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی است. تغییر عملکرد ژن راهی موثر برای تغییر این وضعیت است. بنابراین یک مرحله اساسی، درک مکانیسم مولکولی پاسخ به تنش است که در این مرحله، ژنهای کنترل کننده تنش و گیاهان ترانس ژنیک دارای تحمل بالا نسبت به این تنش شناسایی می گردند (65).
دو ژن CBL4 و HKT1 نقش مهمی در تحمل گیاه جو نسبت به تنش شوری دارند که نقش و اهمیت آنها به طور خلاصه ذکر میگردد. سیگنالهای حاصل از یون کلسیم، مبدَلها و تنظیم کنندههای اصلی در فرآیندهای سازگاری و نموَی گیاهان هستند. این سیگنالها به واسطه اثرات تحریکی خاص ناشی از فعال شدن همزمان کانالها، پمپها و انتقال دهندههایی که به صورت دمائی و فضایی افزایش یون کلسیم را نشان میدهند، بروز مییابند (59). مشخصترین مسیر سیگنالدهی که مختص تنش شوری است نیز شامل افزایش یون کلسیم در سیتوسول میباشد (161). در این مسیر، افزایش القائی یون سدیم در سیتوسول احتمالاً از طریق یک پروتئین calcineurin B-like به نام CBL4 که اصولاً تحت عنوان SOS3 شناخته شده است، تشخیص داده میشود. کمپلکس CBL4/CIPK24 (SOS3/SOS2) از طریق زنجیره اسید چرب مریستول با CBL4/SOS3 پیوند کووالانسی تشکیل میدهد (Ishitani, 2000) که موجب فسفریلاسیون و در نتیجه فعال شدن آنتی ریپورتر Na+/H+ موجود در بخش مرزی غشاء یعنی SOS1 میگردد (104، 106 و 126). سیستم سیگنالدهی CBL/CIPK برای ترجمه سیگنالهای یون کلسیم به شکل فسفریلاسیون پروتئینی است که کمپلکسهای شرکت کننده در پروتئینهای CBL و CIPK هایی را که با آنها اثر متقابل دارند، مانند AKT1، ترانسپورتر یون پتاسیم در آرابیدوپسیس یا SOS1، عامل حساسیت عمومی نسبت به شوری یا CHL، ترانسپورتر نیترات یا AHA2 و H+ATPase 2 در آرابیدوپسیس، را مشخص میکند (86). چند نوع CBL وجود دارد مانند CBL1، CBL4 و CBL9، که با اعضای غشائی در ارتباط هستند (54 و 68). در مورد CBL4/SOS3، نشان داده شده است که مریستوله شدن برای تحمل به شوری مهم و ضروری بوده است (54). اولین CBL شناخته شده با روش ژنتیکی SOS3/CBL4 بوده است. این نشان میدهد که SOS3/CBL4 در تحمل به شوری از طریق حسگر یون کلسیم دارای نقش اختصاصی میباشد. ژنهایی که گیاه را قادر به محدود کردن تجمع یون سدیم در بافت شاخه مینمایند دارای منابع بالقوهای از تحمل نسبت به شوری در اصلاح نباتات هستند. در جو، لوکوس HvNaX4 مقدار یون سدیم در شاخه را بین 12 و 59 درصد کاهش میدهد. بسته به شرایط هیدروپونیک و نوع خاک تأثیر قوی محیط روی بیان این ژن مشخص میگردد (112). لوکوس ژنی HvCBL4 در جو با ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس همولوگ بوده و با HvNaX4 به طور همزمان تفرق مییابد (112).
تحمل به شوری در گیاهان میتواند وابسته به عامل انتقال دهنده HKT[1] باشد که این مولکول اختصاصاً انتقال یونهای سدیم یا انتقال یونهای سدیم و پتاسیم را تسهیل مینماید (86 و132) و در تنظیم هموستازی یون سدیم نقش مهمی ایفاء میکند. در آرابیدوپسیس تالیانا تنها یک ژنHKT (144) و در برنج 8 ژنHKT (33 و 48) وجود دارد. این ژن براساس تشابه توالی آمینو اسیدی دارای دو زیر خانواده میباشد (100) که آنها از نظر انتخاب دو یون سدیم و پتاسیم متفاوت هستند ((33، 48 و 72). اعضای ژنی زیر خانواده اول همگی اجزای انتقال دهنده اختصاصی یون سدیم بوده و اعضای زیر خانواده دوم انتقال دهنده همزمان دو یون سدیم و پتاسیم یا انتقال تک یون سدیم و یا پتاسیم می باشند به استثنای ژن OsHKT2,2 (Oshkt2) در برنج.
شکل 1- شبکه سیگنالدهی CBL-CIPK در پاسخ به تنشهای غیر زنده
محققان گزارش دادند که تحمل نسبت به شوری به طور معنی داری با نسبت یون پتاسیم به یون سدیم مرتبط است (105). آنالیز ترکیبی نشان داد که HvHKT1 اصولاً انتقال یون سدیم را تحت شرایط تنش کنترل میکند، که این نتیجهگیری با آنالیز بیشتر بیان ژن تأیید گردید. همچنین گزارش شده است که در جمعیتهایی که در محیط تحت تأثیر تنش رشد مییابند، طیف وسیعی از تنوع ژنتیکی وجود دارد (88). در جو، مطالعه شده است که بیان ژن HKT1 به وسیله یون پتاسیم تنظیم میشود (150). همچنین گزارش شده است که خانوادههای ژن HKT در هموستازی یون سدیم نسبت به یون پتاسیم دخالت مینمایند که این نشان دهنده اهمیت آنها در تحمل نسبت به شوری است (43). چند مکانیسم در سازگاریهای مورفولوژیکی و بیوشیمیایی دخالت دارند که احتمالاً در حفظ نسبت پائین یون سدیم به یون پتاسیم در سیتوپلاسم نقش دارند. در جو (هوردئوم وولگار)، دو تا از این مکانیسمها وجود دارد که شامل انتقال یون سدیم به داخل واکوئول در عرض غشای تونوپلاستی و انتقال یون سدیم به محیط خارج در سراسر غشای پلاسمائی میباشد (32 و 99). توزیع درون سلولی یون سدیم شامل پمپاژ این یون به داخل واکوئول قبل از افزایش غلظت آن در سیتوپلاسم است (138). این فرآیند از طریق یک شیب گرادیانت pH که به وسیله جابجایی پروتونی H+-ATPase و پیروفسفاتاز غیر آلی ایجاد میگردد، تسریع میشود (31، 37، 62 و 145). افزایش فعالیت آنتیریپورتر Na+/H+ به دلیل افزایش یون سدیم در ریشههای هوردئوم وولگار گزارش شده است (32). مطالعات متعدد اخیر وجود تنوع در تحمل به شوری در میان ارقام هوردئوم وولگار را گزارش نموده است (66 و 115). تحمل به شوری در گیاهان بستگی به ترانسپورترهای HKT دارد که این ترانسپورترها واسطه انتقال اختصاصی یون سدیم یا انتقال همزمان یون سدیم و پتاسیم هستند. ترانسپورترهای HKT دارای دو نقش میباشند: 1- جذب یون سدیم از محلول خاک برای کاهش یون پتاسیم مورد نیاز هنگامی که یون پتاسیم عامل محدود کننده است و 2- کاهش تجمع یون سدیم در برگها با انتقال آنها به داخل فضای آوند چوبی و یا انتقال آنها به داخل فضای آوند آبکش (113).
شکل2- مسیر اختصاصی سیگنال دهی گیاه در پاسخ به تنش شوری (86)
تکنیک اکوتیلینگ
تعیین خصوصیات فنوتیپی جمعیتهای بزرگ یا مجموعههای بزرگ بانک ژنی مشکل و دشوار است. راهحل آن، استفاده از روشی برای صرفه جوئی در زمان و هزینه میباشد. همچنین، توانایی عملی برای تأیید نقش توالیهای ژنی که از طریق برنامههای بررسی بیان توالی ژن در آزمایشات بزرگ به دست میآیند متناسب با سرعت کشف و یافتن آنها نمیباشد. در نتیجه، تعداد زیادی توالی DNA وجود دارد که از طریق تفسیر الکترونیکی با ژنها یا پروتئینهایی که قبلاً خصوصیات آنها تعیین شده همولوژی ندارند و بدین وسیله هیچ عملکرد بالقوهای برای آنها در نظر گرفته نمیشود (11). به علت وجود اطلاعات زیاد در مورد توالیهای ژنی و فقدان آگاهی از عملکرد و نقش آنها، و نیز برای پر کردن فاصله بین ساختار و نقش این توالیها تحقیقات زیادی در زمینه ژنتیک معکوس انجام گرفته است (64). با استفاده از ابزار مولکولی و ژنتیکی، یک صفت موتانت با یک توالی از DNA که عملکرد آن قبلاً شناخته شده است، مرتبط میگردد (17 و 46). اکوتیلینگ روشی است که با آن میتوان به سرعت و به سادگی پلیمورفیسمهای طبیعی (پلیمورفیسمهای تک نوکلئوتیدی (SNP) یا حذف و اضافههای کوچک) را در ژن مورد نظر تعیین نمود (16). این تکنیک بر مبنای تشخیص موتاسیون است و اولین بار توسط کومای و همکاران معرفی گردید که در واقع از تکنیک تیلینگ برای یافتن موتاسیون در جمعیت طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا استفاده گردید. این روش برای جو(Hordeum vulgar L.) (76)، هندوانه (Cucumis melo L.) (91)، گندم(Triticum aestivum L.) (152)، بادام زمینی وحشی (Arachis duranensis K & G) (109) و در تعدادی از گیاهان آبزی مانند (Monochoria vaginalis B.)(151) به کار برده شد. با استفاده از این روش، تعیین آللهای مختلف ژنهای هدف و کاهش تعداد نمونههایی که باید تعیین فنوتیپ گردند، امکانپذیر میشود. معمولترین شکل تنوع ژنتیکی SNP است، به خصوص آللهای نادری که فراوانی آنها کمتر از 5% است نقش مهمی در فنوتیپ ایفاء مینمایند. اثرات بسیار مؤثر آللهای نادر روی صفات کمّی و بیماریهای پیچیده در تحقیقات زیادی گزارش شده است (14 و 114). برخی از SNP ها از طریق تغییر توالی آمینو اسید یا ناقص کردن پروتئینها عملکرد ژن را تغییر میدهند (109).
مزیتهای تکنیک اکوتیلینگ شامل موارد زیر است: 1- این تکنیک در همه گیاهان و جانوران، حتی گونههایی که قادر به موتانت زایی نیستند، قابل کاربرد است (35)، 2- قابلیت تعیین تنوع در تعداد تکرار ستلایتها (SSRs) را دارد (139)، 3- قابلیت تعیین سطوح هتروزیگوسیتی در گونههای دگرگشن با هتروزیگوسیتی بالا را دارد (35) و 4- ظرفیت تشخیص پلی مورفیسمهای چند گانه در یک قطعه مجزا را دارد (139). مزایای تکنیکی روش اکوتیلینگ در مقایسه با سایر روشهای مولکولی به این دلیل است که روشهای ارزیابی بر اساس حرکت ژل، مانند الکتروفورز ژل گرادیانت (DGGE) و پلی مورفیسمهای تک رشتهای (SSCP) قادر نیستند محل و نوع پلی مورفیسم در قطعه DNA را تعیین کنند (21). تکنیکهای دنیچره کردن و PCR نیز صرفاً برای قطعات کوچک DNA استفاده میشوند و تکنیک مبتنی بر آرایه میتواند 50% از SNPها را بیابد و در این میان، روش توالییابی برای این منظور بسیار مناسب و دقیق میباشد. این روش در گذشته برای ارزیابی جمعیتهای بسیار بزرگ پر هزینه بود اما امروزه با پیشرفت سریع در تکنیکهای توالییابی به عنوان روشی کم هزینهتر و با راندمان بالاتر و همچنین استفاده از نرم افزارهایی که تجزیه و تحلیل دادههای توالییابی را تسریع و تسهیل میکنند، کاربرد این تکنیک بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. به گونهای که اخیراً یکی از جدیدترین تکنیکهای تیلینگ و اکوتیلینگ انجام این روشها با استفاده از توالییابی است که با صرف هزینه کمتر و در مدت زمان کوتاهتر برای مطالعه تنوع در ژنهای چند آللی در جمعیتهای موتانت و طبیعی به کار میرود. با استفاده از روش توالییابی، ضمن برخورداری از کلیه مزایای تیلینگ و اکوتیلینگ، میزان سرعت و دقت در یافتن پلی مورفیسمهای تک نوکلئوتیدی و نیز سایر انواع پلی مورفیسمها به حداکثر میرسد (35).
هدف از این تحقیق، تعیین تنوع آللی ژنهای کاندیدای تحمل به تنش شوری در ارقام و ژنوتیپهای جو، جستجوی آللهای جدید، آنالیز روابط فیلوژنی میان ژنوتیپهای مورد مطالعه، و طبقهبندی ژنوتیپها در قالب گروههای هاپلوتیپی بوده است. بدین منظور، از تکنیک اکوتیلینگ به کمک توالی یابی[2] که یک تکنیک مدرن و بسیار کارآ میباشد برای یافتن انواع پلیمورفیسمهای نوکلئوتیدی در دو ژن CBL4 و HvHKT1 (ژنهای کنترل کننده تنش شوری) در ارقام مورد مطالعه جو در این تحقیق استفاده گردیده است. این دو ژن در کنترل شوری نقش بسیار مهم و اساسی دارند. در مطالعه حاضر، از تنوع نوکلئوتیدی این ژنها در ارقام و ژنوتیپهای متعلق به مناطق مختلف شور در دنیا برای یافتن منابع جدید و بالقوه تحمل به تنش شوری استفاده شده است. ضرورت انجام چنین تحقیقی این بوده است که علیرغم تحقیقات فراوان در زمینه اصلاحات ژنتیکی و وجود مکانیسمهای سازگاری، بسیاری از گیاهان با مشکل کاهش عملکرد مواجه میباشند. یکی از عوامل اصلی کاهش عملکرد در گیاهان به ویژه گیاهان زراعی، اثرات سوء تنشهای غیر زنده است. از میان تنشهای غیر زنده، تنش شوری یکی از عوامل بسیار مهم کاهش عملکرد و هدر رفتن محصول گیاهی است. لذا، این تحقیق با هدف یافتن منابع بالقوه مقاومت به شوری در ژنوتیپهای جو اجرا گردیده است.
فصل اول- بررسی منابع:
پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) به صورت یک تغییر تک بازی در توالی DNA که با نسبت معنی داری (بیش از یک درصد) در یک جمعیت بزرگ اتفاق میافتد، تعریف میشود. SNPها در سراسر ژنوم در چهارچوب الگوهای خاصی به نام بلوک هاپلوتیپی حفظ میگردند. پلیمورفیسمهای SNP به این دلیل مفید هستند که اغلب با یک صفت خاص مرتبط میباشند و به آنها صفات وابسته به ژنتیک گفته میشود. هاپلوتیپها مجموعهای از مارکرهای ژنتیکی پیوسته با هم روی یک کروموزوم هستند که با یکدیگر توارث مییابند و با نوترکیبی به راحتی از یکدیگر جدا نمیشوند. از تکنیک اکوتیلینگ میتوان برای طبقه بندی هاپلوتیپی ژنوتیپها استفاده نمود. اولین بار، کومای و همکاران (2004) با استفاده از تکنیک اکوتیلینگ پلیمورفیسم DNA را در جمعیتهای طبیعی آرابیدوپسیس تالیانا مطالعه نمودند. آنها در 5 ژن از 150 گیاه، 55 هاپلوتیپ یافتند که این هاپلوتیپها طیفی از تفاوتها از جمله پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی تا هاپلوتیپهای پیچیده را نشان دادند. کوکرام و همکاران (2007) نیز با کمک این تکنیک هاپلوتیپهای دو ژن VRN-H1 و VRN-H2 را در 429 واریته جو تعیین نمودند. آنالیز ژنوتیپی، دادههای توالییابی اینترون یک و آزمونهای عادت رشدی این گیاه وجود سه آلل جدید VRN-H1 را نشان داد و فراوانترین نوآراییهای اینترون یک را تعیین نمود. آنالیز ترکیبی آللهای VRN-H1 و VRN-H2 موجب طبقهبندی 7 هاپلوتیپ چند لوکوسی VRNH1/VRNH2 گردید که سه تا از آنها در 79% از واریتهها وجود داشتند. سینگ و همکاران (2010) هاپلوتیپهای SNP در ژن BADH1 را در 127 واریته و نژاد بومی برنج مورد مطالعه قرار دارند. محصول پروتئینی این ژن (بتائین گلیسین) آنزیمی است که در بسیاری از گونهها به عنوان یک اسموپروتکتنت قوی در مقابل تنش شوری و خشکی عمل میکند. این محققان از طریق توالییابی مجدد واریتههای مختلف برنج که از نظر تحمل به شوری و داشتن عطر متنوع هستند SNPهای مربوط به ژن BADH1 را پیدا نموده و تأیید کردند. آنها SNP 17 در اینترون و SNP 3 در اگزون یافتند که هر سه SNP اگزونی موجب تغییردر آمینو اسید همراه با تغییر معنیدار عملکرد ژن گردیدند. در ارزیابیهای مرکب SNP در 127 واریته مختلف برنج مجموعاً 15 هاپلوتیپ گزارش گردید که 4 تا از آنها با دو هاپلوتیپ پروتئینی مرتبط بودند و در 85% از ارقام وجود داشتند. نتایج این مطالعه نشان داد که واریتههای معطر برنج رابطه خاصی با هاپلوتیپ پروتئینی BADH1 که موجب تبدیل اسید آمینههای لیزین به آسپاراژین و لیزین به گلوتامین گردید، نشان دادند. چن و همکاران (2011) با استفاده از روش تغییر یافته اکوتیلینگ، SNPهای ژن VRN-A1 را در گندم (Triticum aestivum L.) تعیین نمودند. آنها SNP های این ژن را در 106 ژنوتیپ از واریتههای هگزاپلوئید گندم جستجو کرده و از فنوتیپ زمستانه یا بهاره بودن برای طبقهبندی هاپلوتیپی آنها استفاده کردند. آنها سه هاپلوتیپ، هر یک با 5، 6 و 3 تغییر نوکلئوتیدی یافتند. سه تا از این SNPها با بهاره بودن گندم مرتبط بود. آنها از اکوتیلینگ قطعات DNA روی ژل آگارز برای تشخیص SNPها استفاده کردند و گزارش نمودند که این روش برای تعیین SNPها در ژنهای گیاهان پلیپلوئید مانند گندم کارآیی دارد. ژانگ و همکاران (2011) ژن desmoglein 4 (DSG4) در گوسفند را که نقش مهمی در تنظیم رشد و تمایز فولیکولهای مو در پستانداران دارد مورد مطالعه قرار دادند. آنها یک قطعه bp 755 از این ژن را در 544 نمونه گوسفند متعلق به 9 نژاد بومی چین و دو نژاد غربی غربال نموده و در دو قطعه از سه قطعه مورد بررسی پلی مورفیسم مشاهده کردند. نکته جالب این بود که پلیمورفیسمها در این دو قطعه دارای عدم تعادل لینکاژی قویی بودند. آنها سه هاپلوتیپ یافتند. توالیهای سه هاپلوتیپ 7 پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNPs) و یک حذف و اضافه TTG را نشان دادند که موجب جابجایی 5 آمینواسید و حذف و اضافه آمینو اسید گلیسن گردید. شبیر و همکاران (2011) در دو نژاد بوفالوی جعفر آبادی و سورتی هاپلوتیپها و فیلوژنی مرتبط با 20 توالی نوکلئوتیدی ژن OLR1 را آنالیز و بررسی نمودند. آنها در جمعیت مورد مطالعه خود چهار هاپلوتیپ با فراوانیهای 05/0، 1/0، 15/0 و 7/0 یافتند. همچنین آنها دادههای خود را براساس همولوژی مناطق ژنی مورد بررسی در چهار گروه طبقه بندی نمودند. بنابراین نتیجهگیری میگردد که تکنیک اکوتیلینگ کارآئی بالایی در طبقه بندی هاپلوتیپها، تعیین رابطه آنها با صفات مورفولوژیکی و تخمین فراوانی آنها دارد.
پلیمورفیسم ژنتیکی، تفاوت در توالی DNAی افراد، گروهها یا جمعیتها است که شامل یک یا تعداد بیشتری SNP میباشد. موتاسیون ژنتیکی، تغییر در توالی نوکلئوتیدی یک مولکول DNA است. استفاده از اکوتیلینگ برای یافتن پلی مورفیسم DNA و تنوع آللی ژنها یکی دیگر از موارد کاربرد این تکنیک است. ملحِد و همکاران (2006) از تکنیک اکوتیلینگ برای یافتن پلیمورفیسم DNA در ژنهای mlo و Mlaی جو استفاده کردند. آنها 11 لاین موتانت mloی جو، رقم اینگرید (mlo WT) و 25 لاین جو که شامل ارقامی از اروپا، لاینهای تقریباً ایزوژن و لاینهای مشتق شده از جوی وحشی که دارای آلل Mla بودند را مورد بررسی و آزمایش قرار دادند. این پژوهشگران نتیجه گرفتند که امکان ترکیب آللهای متفاوت mlo با آللهای مختلف Mla از جوی وحشی وجود دارد تا بدین وسیله ارقامی با مقاومت طولانیتر نسبت به بیماری سفیدک جو به دست آید. نیتو و همکاران (2007) از این تکنیک برای تعییین تنوع آللی eIF4E، فاکتوری که حساسیت به ویروس را کنترل میکند، در هندوانه استفاده کردند. آنها 113 ژنوتیپ از گونههای کوکومیس را برای حساسیت نسبت به ویروسهای MNSV و CVYV مطالعه و بررسی نمودند. این محققان دریافتند که 6 محل پلیمورف به صورت بسیار حفاظت شده در مناطق اگزونی این ژن وجود دارد که یکی از آنها با مقاومت نسبت به MSNV مرتبط بوده و بقیه موتاسیونهای خاموش بودند. همچنین آنها یک آلل جدید از این ژن را در یکی از خویشاوندان هندوانه به نام کوکومیس زِیری[3]، یافتند. آنالیز عملکرد ژن نیز نشان داد که این آلل جدید احتمالاً مسئول مقاومت به MNSV است. راموس و همکاران (2009) با استفاده از تکنیک اکوتیلینگ یک ارتولوگ هیپو آلرژی از لوکوس Ara h 2.01 را در بادام زمینی تشخیص داده و بررسی کردند. آنها به کمک روش اکوتیلینگ 5 موتاسیون مختلف از بین برنده فعالیت ژن d 2.01 را در ژنوتیپهای بادام تعیین نمودند. به علاوه، یک پلیمورفیسم در اپیتوپ (بخشی از آنتیژن که به وسیله سیستم ایمنی به ویژه آنتیبادیها، سلولهای B و T تشخیص داده میشود) غالب ایمنی #7 (S73T) تشخیص داده شد که موجب کاهش 99- 56 درصدی فعالیت باندینگ IgE گردید. وانگ و همکاران (2010) با استفاده از تکنیک اکوتیلینگ پلیمورفیسمهای ژنFAE1 ، که در ارتباط با محتوی اسید اوریک است، را در سه گونه از براسیکا مطالعه نموده و از آن برای تعیین رابطه ژنومی جنسهای گونه براسیکا استفاده نمودند. آنها هفت ژنوتیپ براسیکا راپا[4]، 9 ژنوتیپ براسیکا اولراسا[5] و 101 ژنوتیپ براسیکا ناپوس[6] را مورد آزمایش قرار دادند. نتایج این مطالعه نشان داد که 3 پلیمورفیسم در دو پارالوگ FAE1 گونه ناپوس یافت گردید که این پلی مورفیسمها رابطه قویی با تفاوت مقادیر اسید اوریک بذر داشتند. در توالیهای ژنومی ژن FAE1 متعلق به 7 ژنوتیپ براسیکا راپا یک پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی در منطقه کد کننده ژن یافت شد که موجب کاهش عملکرد ژن گردید. آنالیز مولکولی تکامل همولوگهای ژن FAE1 نشان داد که رابطه بین ژنومهای A و C در براسیکا نزدیکتر از رابطه ژنومهای A/C و ژنوم آرابیدوپسیس است. مرتب کردن توالیهای کد کننده این همولوگهای FAE1 و مقایسه آنها نشان داد که 18SNP متفاوت بین ژنومهای A و C وجود داشته که می توانند به عنوان مارکرهای اختصاصی ژنوم در براسیکا استفاده گردند. وان هوت و همکاران (2012) مناطق کد کننده ژن سندرم NBS را در 10 فرد مبتلا به این بیماری توالییابی کرده و در 8 نفر از آنها در ژن SMARCA2 تنوعهای هتروزیگوسی یافتند. غربالگری گسترده مولکولی نشان داد که در 36 فرد از 44 فرد مبتلا به این سندرم موتاسیونهای ناهمگن در ژن SMARCA2 وجود داشت. هنگامی که این موتاسیونها با نمونههای والدینی مقایسه شدند تأیید گردید که آنها موتاسیونهای جدید میباشند. این موتاسیونها در داخل توالیهایی گروهبندی شدند که موتیفهای بسیار حفاظت شده در منطقه کاتالیکی ATPase پروتئین را کد میکنند. این تکنیک برای تشخیص انواع آللهای جدید ژنی، بیان رابطه ارتولوگی آنها و همچنین رابطه بین ژنومهای گونههای مختلف کاربرد دارد.
از تکنیک اکوتیلینگ میتوان برای تخمین فراوانی نسبی SNP در قطعه یا قطعات مورد نظر ژنوم استفاده نمود. ارزیابی فراوانی SNP میتواند اطلاعات زیادی در مورد مناطق حفاظت شده ژن و مسیر تکاملی جنسها و گونههای مختلف در اختیار قرار دهد. گیلکریست و همکاران (2006) با استفاده از این تکنیک، تنوع ژنتیکی در جمعیت طبیعی Populus trichocarpa را مورد مطالعه قرار دادند. آنها تنوع ژنتیکی مربوط به 9 ژن را در افراد 41 جمعیت مختلف بررسی نمودند. مقدار تنوع در ژنهای مورد مطالعه آنها بسیار متفاوت بوده و از یک SNP در ژن PoptrTB1 تا بیش از SNP 23 در هر bp 1000 از ژن PoptrLFY متغیر بوده است. الیزا و همکاران (2009) تکنیک اکوتیلینگ را در سیب زمینی (Solanum tuberosum L) بهینهسازی کردند. آنها در هر کیلوباز 15 پلیمورفیسم تک نوکلئوتیدی یافتند. نه پلیمورفیسم از آن، مختص یکی از سه رقم تتراپلوئید مورد مطالعه بود. ایبیزا و همکاران (2010) با استفاده از اکوتیلینگ منابع جدیدی از مقاومت ویروسی را در گونههای پنبه یافتند. آنها برای 233 ژنوتیپ بومی جنس کاپسیکم یک پلت فرم اکوتیلینگ بر مبنای cDNA ارائه داده و ارزیابی نمودند. با استفاده از این پلت فرم تنوع بالایی در توالیهای کد کننده ژنهای eIF4 و eIF(iso)4E تشخیص داده شد. این محققان 5 واریانت جدید از ژن eIF4E (pvr210, pvr211, pvr212, pvr213 and pvr214) گزارش دادند که در ارتباط با واکنش مقاومتی نسبت به ویروس PVY بوده است. سِری و همکاران (2011) در 96 ژنوتیپ جو آللها و هاپلوتیپهای 9 ژن کاندیدای تحمل به خشکی را مطالعه نمودند. آنها SNP 185 گزارش دادند و با تکنیک اکوتیلینگ 46 موتاسیون حذف و اضافه با میانگین یک SNP در bp 92 و یک موتاسیون حذف و اضافه در bp 372 از توالی ژنومی را تعیین نمودند. کلهر و همکاران (2011) مقادیر SNPها در جمعیتهای وحشی Populus tremuloides Michx. را تعیین نموده و مشخص کردند. آنها در مجموع 35 منطقه ژنی را در چهار جمعیت آنالیز کردند. لوسای انتخابی آنها اصولاً در تشکیل پشم نقش داشتند و شامل ژنهایی بودند که در بیوسنتز لیگنین، بیوسنتز سلولز و سایر ترکیبات دیواره سلولی دخالت مینمایند. همچنین ژنهای کد کننده هورمونهای رشد، مقاومت به بیماری و واکنش به نور از جمله ژنهای مورد مطالعه آنها در این تحقیق بود. این پژوهشگران مجموعاً 462 SNP در kb 25 یافتند که بیش از SNPs/kb 18 میباشد. بنابراین، SNP ها مارکرهای مولکولی فراوان و مفیدی در این گیاه میباشند.
برای نقشهیابی ژن با روشی ساده و کم هزینه میتوان از تکنیک اکوتیلینگ با ژل آگارز استفاده نمود. راقاوان و همکاران (2007) از این روش سریع برای تشخیص SNPها در تهیه نقشه برای ژنهای کاندیدای برنج استفاده کردند. آنها از ژل آگارز برای این هدف استفاده نموده و اثبات کردند که این روش میتواند به صورت کارآئی در نقشهیابی ژن به کار رود و به ویژه برای لاینهای والدینی که سطوح پلیمورفیسم در آنها پائین است مفید میباشد. هزینه کمتر و سادگی این تکنیک موجب کاربرد گستردهتر آن در مطالعات مربوط به مارکرهای مبتنی بر SNP برای تعیین خصوصیات ژرمپلاسم و مطالعات نقشهیابی میگردد.
روشهای مختلف تشخیص SNP دارای کارآئی متفاوتی میباشند. اکوتیلینگ با تشخیص انواع مختلف پلی مورفیسم نظیر حذف یا اضافه، آسیب ژنی و توالی های کوچک تکراری بدون تولید موجوداتی که از نظر ژنتیکی تغییر یافتهاند (16)، دارای کارائی بسیار بالایی میباشد. موتاسیونهای چندتایی و حذف و اضافههای کوچک با اکوتیلینگ قابل تشخیصاند. بنابراین، میتوان از این روش به عنوان یک مارکر پلی مورفیسم چند نوکلئوتیدی (MNP) استفاده نمود که از مارکر SNP که صرفاً موتاسیون تک نقطهای را تشخیص میدهد کارآتر است (76). اکوتیلینگ تکنیکی با راندمان بالا است که قابلیت تعیین عملکرد موتاسیونهای نادر توسط آن، مؤثرتر و سریعتر از سایر روشها است (13). هیونگ و همکاران (2008) دو روش استفاده از اندونوکلئاز اختصاصی جفت باز اشتباهی و کروماتوگرافی مایع را برای تشخیص موتاسیونها در ژن بتا تالاسمی (HBB) با هم مقایسه نمودند. آنها گزارش دادند که روش استفاده از اندونوکلئاز دارای 100% حساسیت برای تشخیص موتاسیون است. کورینا و همکاران (2010) از آنالیز هتروروپلکس برای تعیین ژنوتیپ SNP در آفتابگردان استفاده کردند. آنها برای ژنوتیپیابی مجموعهای از 24 ژن کاندیدای پلیمورف انتخابی دو روش CEL1CH و dHPLC را با هم مقایسه کردند. ده منطقه از 24 منطقه ژنی دقیقاً به وسیله روش CEL1CH تشخیص داده شده و 11 منطقه ژنی برای آنالیز از طریق dHPLC بهینهسازی شدند. هر دو روش برای تهیه نقشه ژنتیکی استفاده شدند و برای این منظور SNP 42 از نوع موتاسیون حذف و اضافه در 22 ژنوتیپ آفتابگردان و SNP 33 حذف و اضافه در 90 اینبرد لاین نوترکیب برای تولید این نقشه استفاده گردید. آنها نتیجهگیری کردند که میتوان این دو روش را به صورت روشهای مکمل برای مطالعات ژنتیکی و تعیین تنوع ژرم پلاسمی (اکوتیلینگ) به کار برد. بونو و همکاران (2011) با استفاده از تکنیکهای اکوتیلینگ و HRM بیماران مبتلا به اندرسون- فابری (FD) را از نظر ژنتیکی غربال کردند. این بیماری به وسیله نقص عمل آنزیم آلفا- گالاکتوزیداز که توسط ژن GLA کد میشود، ایجاد میگردد. نتایج مطالعه آنها نشان داد که همه موتاسیونها به وسیله روش HRM تشخیص داده شدند، در حالی که 17% از آنها با اکوتیلینگ تشخیص داده نشدند. مقایسه نتایج اکوتیلینگ با آنزیم CELI و ENDO-1 به میزان زیادی با هم همپوشانی داشتند. جگادسان و همکاران (2011) از اکوتیلینگ به عنوان یک تکنیک مارکری کمکی برای آنالیز مولکولی ژنهای گلیسین در موتانتهای سویا استفاده کردند. آنها ژنهای Gy1, Gy2, Gy3 و Gy5 که ذخیره پروتئینی بذر را کنترل میکنند را مورد مطالعه قرار دادند. این محققان گزارش نمودند که آنالیز پروتئین بذر با مارکرهای اختصاصی ژن در مقایسه با روش SDS- PAGE آسانتر، سریعتر و دقیقتر است و نیاز به در اختیار داشتن بذر نمیباشد. همچنین، این آنالیز میتواند در هر مرحله از رشد گیاه انجام گیرد. تسای و همکاران (2011) موتاسیونهای نادر در جمعیتهای برنج و گندم را با روش تیلینگ به وسیله توالییابی جستجو و مطالعه نمودند. آنها با استفاده از روشی مبتنی بر توالییابی ایلومینا، 768 نمونه گیاهی از برنج و گندم را به طور موازی و هم زمان آزمایش و بررسی کردند. آنها نتیجهگیری کردند که این روش در مقایسه با سایر روشهای تیلینگ، مانند برش آنزیمی هترودوپلکسها، روش استفاده از dHPLC و HRM، حساسیت بیشتری برای تشخیص پلیمورفیسم داشته و روشی تخصصی تر است.
تحقیقات اخیر در این زمینه مربوط به توالی یابی ترنسکریپتوم ژنهای مسئول صفات مهم مانند انواع تنشهای زنده و یافتن موتاسیونهای تک نوکلئوتیدی در آنها که منجر به تغییر معنی دار عملکرد ژن میگردد، میباشد.
مکانیسم ژنتیکی، بیوشیمی و فیزیولوژیکی تحمل به شوری
بیان ژنهای مرتبط با تحمل نسبت به تنش شوری در گیاه جو در مراحل مختلف رشد گیاه بسیار متفاوت است. والیا و همکاران (2007) بیان ژن در طول تنش شوری را در جو آنالیز کردند. نتایج مطالعه آنها نشان داد که شکل خاصی از واکنش نسبت به شوری، القای ژنهایی است که در بیوسنتز اسید جاسمونیک دخالت دارند و ژنهایی که در پاسخ به تیمار اسید جاسمونیک شناخته شدهاند. تعداد زیادی از ژنهای مرتبط با تنشهای غیر زنده (مانند گرما، خشکی، و دمای پائین) با واکنش نسبت به شوری در ارتباطاند. نتایج این پژوهشگران نشان داد که اسموپروتکشنها اولین واکنش گیاه جو نسبت به تنش شوری هستند. لی و همکاران (2009) از یک روش RT-PCR متفاوت بر مبنای پرایمر با دمای انلینگ کنترل شده (ACP) برای تشخیص بیان ژنهایی که در برگ جو تحت تنش شوری به صورت متفاوتی بیان میگردند (DEGs)، استفاده کردند. آنها برخی ژنهای جدید مانند SnRK1- پروتئین کیناز، که 17 کیلو دالتون و کلاس I میباشند، پروتئین کوچک شوک حرارتی و ماده اولیه پروتئین RNase S-like را تشخیص دادند که این اطلاعات برای توسعه استراتژیهای بعدی برای تحمل شوری مفید میباشد. مولر و همکاران (2009) تجمع یون سدیم در شاخه و افزایش تحمل به شوری، که با تغییر نوع خاصی از سلولهای انتقال دهنده یون سدیم در آرابیدوپسیس مهندسی شده است، را مورد بررسی قرار دادند. آنها نشان دادند که بیان ژن انتقال دهنده یون سدیم HKT1:1 در سلولهای بالغ ریشه آرابیدوپسیس تالیانا تجمع این یون در شاخه را به میزان 37 تا 64 درصد کاهش داد. بیان HKT1:1 به ویژه در ریشه بالغ با استفاده از سیستم بیان تقویت شده برای بیان کاملاً اختصاصی و قوی انجام میگیرد. این عمل در شاخه به کمک HKT1:1 و با افزایش جریان یون سدیم به داخل سلولهای ستارهای شکل صورت میگیرد و موجب کاهش انتقال یون سدیم از ریشه به شاخه میگردد. گیاهانی که یون سدیم کمتری در شاخه دارند نسبت به شوری متحملتر هستند. نتایج مطالعه این محققان نشان داد که تغییر فرآیند اختصاصی انتقال یون سدیم در انواع خاصی از سلولها میتواند تجمع این یون در شاخه را کاهش دهد که این امر جنبه مهمی از تحمل به شوری در بسیاری از گیاهان عالی است. والیا و همکاران (2009) الگوهای بیان ژنومی برنج و جو را در ارتباط با واکنش نسبت به تنش شوری با هم مقایسه نمودند. آنها این فرضیه را تأیید کردند که علائم ترنسکریپتومی حفاظت شده در پاسخ به عوامل محیطی وابسته به شباهت ژنتیکی میان ژنوتیپهای موجود در داخل یک گونه و همچنین وابسته به فاصله فیلوژنی بین گونهها میباشد. محمدی نژاد و همکاران (2010) با بررسی ژنوتیپی تحمل به تنش شوری در 30 ژنوتیپ برنج در مرحله گیاهچگی آنها را بر اساس مارکرهای میکروستلایتSaltol QTL, RM8094 و RM10745 به 16 هاپلوتیپ تقسیم نمودند. دیو و همکاران (2010) تفاوتهای نسخهبرداری و ترجمه ژن دهیدرین را بین واریته جوی تیبتان هیکینک شماره 1 و جوی وحشی تحت شرایط تنشهای شوری، خشکی و دمای پائین بررسی نمودند تا مکانیسم تحمل به تنش را در واریته تیبتان هیکینک ترسیم کنند. آنها گزارش دادند که کمبود الکترولیت، محتوی مالوندیالدهید و H2O2 در جوی وحشی سریعتر از جوی لخت تیبتان، افزایش مییابد که این امر نشان میدهد جوی وحشی بیش از جوی لخت تیبتان، آسیب میبیند و واریته هیکینک شماره 1 دهیدرینهای بیشتری نسبت به جوی وحشی حساس به تنش ذخیره میکند. کیو و همکاران (2011) تحمل به شوری را در 189 ژنوتیپ مشتق شده از جوی وحشی تیبتان که از نظر تحمل به شوری متفاوت بودند با استفاده از تعیین غلظت یونهای سدیم و پتاسیم ارزیابی کردند. همچنین، آنها عملکرد آللی HvHKT1 و HvHKT2 را در جوی وحشی تیبتان آنالیز کردند. از نظر تحمل به شوری تنوع وسیعی میان ژنوتیپهای جوی وحشی وجود داشت. برخی از ژنوتیپها نسبت به رقم زراعی CM 72 جو متحملتر بوده و تحمل به شوری به طور معنیداری وابسته به نسبت یون پتاسیم به یون سدیم بود. آنالیز همبستگی نشان داد که این دو ژن اصولاً انتقال یون سدیم و یون پتاسیم را تحت تنش شوری کنترل میکنند که این امر با آنالیز بعدی بیان ژن تأیید گردید. نتایج این مطالعه نشان داد که جوی وحشی تیبتان دارای آللهای الیت از این دو ژن میباشد که موجب تحمل به شوری میگردد. ریواندی و همکاران (2011) یک لوکوس کنترل کننده ذخیره یون سدیم، SOS3 که با HvNaX4 همولوگ بوده و روی بازوی بلند کروموزوم شماره یک جو قرار دارد، را به خوبی نقشهیابی کردند. ژن HvCBL4 جو یک همولوگ بسیار نزدیک به ژن متحمل به شوری SOS3 در آرابیدوپسیس است که هم زمان با HvNaX4 تفرق مییابد. آنها این لوکوس را روی کروموزوم شماره یک نقشهیابی کرده و دریافتند که لوکوس HvNaX4 میزان یون سدیم در شاخه را بین 12 و 59 درصد کاهش میدهد یا بسته به شرایط رشد هیدروپونیک و طیفی از انواع خاکها اصلاً این میزان را کاهش نمیدهد. این امر نشان دهنده تأثیر قوی محیط روی بیان ژن است. این محققان در بیان mRNAی لوکوس HvCBL4 بین والدینی که نقشهیابی شدند تفاوتی مشاهده نکردند. بنابراین آنها گزارش دادند که HvCBL4 یک ژن کاندیدا برای HvNaX4 است که باید بیشتر مورد بررسی و مطالعه قرار گیرد.
تحت تنش شوری غلظت یونهای پتاسیم و سدیم به شدت تغییر مییابد. تغییر غلظت این یونها تحت تأثیر ژنهای کنترل کننده این تنش و طی مسیرهای خاص بیوشیمیایی صورت می گیرد. یکی از راههای مطالعه مکانیسم این ژنها استفاده از موتاسیونهای مربوط میباشد. والیا و همکاران (2007) یک رقم متحمل به شوری در جو به نام گلدن پرامیس که حاصل موتاسیون القائی با پرتوتابی در رقم میتورپ میباشد را مورد مطالعه قرار دادند. گلدن پرامیس حاصل یک موتاسیون منفرد در لوکوس Ari-e روی کروموزوم شماره 5 جو است. این رقم یون سدیم کمتری نسبت به رقم والدینی خود در شاخهها ذخیره مینماید و هدف از این مطالعه تشریح اساس ژنتیکی و مکانیسم این تفاوت بوده است. نتایج این تحقیق نشان داد که این دو رقم از نظر ژنتیکی بسیار به هم نزدیک بوده اما ایزوژنیک نمیباشند و این به دلیل وجود سه بلوک هاپلوتیپ پلیمورف است. آنالیز ترینسکریپتوم نشان داد که واکنش این دو ژنوتیپ به تنش شوری کاملاً متفاوت است. همچنین، واکنش آنها نسبت به تنش شوری در بافت ریشه و شاخه بسیار متفاوت است. روش دیگر برای مطالعه این مکانیسمها استفاده از رادیو ردیابها می باشد. کودلا و همکاران (2010) عملکرد سیگنال دهی یون کلسیم در گیاهان را مطالعه نمودند. زیرا این یون در واکنشهای متعدد گیاه نسبت به محرکهای زنده و غیر زنده از جمله نور، دمای بالا یا پائین، شوری و خشکی نقش دارد. آنها توانستند اصول دقیق مکانیسمی را تشریح کنند که تحت آن تشخیص و تغییر جریان اختصاصی یون کلسیم در سلول به صورت واکنش متقابل پروتئین با پروتئین، فسفریلاسیون پروتئین و بیان ژن تعریف میگردد و به موجب آن ویژگی پاسخ به تحریک محیطی به طور هم زمان بررسی میشود. لیگابا و همکاران (2010) با مقایسه ارقامی از جو که از نظر حساسیت نسبت به شوری متفاوت بودند مکانیسمهای تحمل به شوری را در آنها مطالعه کردند. آنها واکنش تحمل به شوری را در سطوح فیزیولوژیکی و مولکولی در ارقام متحمل (K305) و حساس به شوری (1743) بررسی نمودند. این محققان گزارش دادند که آنالیز بیان ژن با استفاده از RT-PCR کمّی نشان داد که تعداد نسخههای ژنهای انتقال دهنده یون پتاسیم (HvAKT1 و HvHAK1)، H+-ATPase واکوئولی و پیروفسفاتاز غیرآلی (HvHVP1 و HvHVA/68) در شاخههای KK305 فراوانتر از 1743 بود. بیان انتقال دهندههای ژن HvHAK1 و /H+ Na+ (HvNHX1, HvNHX3 و HvHNX4) هنگام قرار گرفتن طولانی مدت در معرض شوری در ریشههای K305 بیش از ریشههای 1743 بود. نتایج این مطالعه پیشنهاد می کند که عملکرد بهتر رقم K305 در مقایسه با رقم 1743 در طول تنش شوری ممکن است با قابلیت بیشتر آن برای توقیف یون سدیم در زیر بخشهای سلولی و یا حفظ هموستازی یون پتاسیم مرتبط باشد.
امروزه آنالیز ترکیبی ژنهای مسئول تنشهای زنده در گیاهان همراه با بررسی بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی آنها صورت میگیرد تا از این طریق درک بهتری از مکانیسم عمل این ژنها و شناسائی منابع مقاوم با استفاده از فرآیندهای متأثر از آنها انجام گیرد.
فصل دوم- مواد و روشها
2-1 فرضیات تحقیق
فرضیات این آزمایش شامل تشخیص آللها جدید و گروهبندی هاپلیوتیپی ژنوتیپهای مورد بررسی با استفاده از تنوع تک نوکلئوتیدی (SNP)، استفاده از تنوع هاپلوتیپی برای طبقهبندی اکوتیپها و کاهش هزینه، زمان و افزایش دقت نسبت به سایر روشهای مطالعه تنوع تک نوکلئوتیدی بوده است.
بخش عمده مراحل اجرائی این تحقیق در مرکز بین المللی تحقیقات کشاورزی در مناطق خشک (ICARDA) و بخشی دیگر در پژوهشکده بیوتکنولوژی کشاورزی کرج (ABRII) انجام گرفته است.
2-2 مواد گیاهی
در این تحقیق از 96 ژنوتیپ جو که در مناطق مختلف شور در جهان از جمله ایران کشت میگردند، به عنوان مواد گیاهی استفاده گردید که لیست اسامی و مشخصات آنها در بخش ضمیمه ذکر گردیده است. هدف از انتخاب این مواد بررسی تنوع ژنی مقاومت به شوری در ژنوتیپهای متعلق به مناطق متعدد جغرافیایی بوده است. زیرا طبق مطالعات قبلی، ژنوتیپهایی که در مناطق شور رشد و نمو مییابند دارای تنوع بیشتری از نظر دارا بودن ژنهای متحمل به شوری میباشند.
2-3 طراحی پرایمر
طراحی پرایمرها با استفاده از دادههای ژنومی جو که در پایگاه اطلاعاتی GeneBank موجود است، انجام گرفت. با توجه به اینکه این پرایمرها اختصاصی بوده و برای مطالعه عملکرد ژن طراحی شدند، از مناطق کد کننده ژن به عنوان توالیهای اولیه برای طراحی پرایمر استفاده گردید. ژن های مورد مطالعه در این تحقیق دو ژن متحمل به شوری CBL4و HKT1 بوده است. برای طراحی پرایمرها از نرم افزار آنلاین(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) Primer3 استفاده شد.
2-4 مدل ژنی ژنهای استفاده شده برای طراحی پرایمرها
مدل ژنی ژن CBL4 در شکل 2- 1 نشان داده شده است. همچنین توالی کامل مناطق کد کننده و غیر کد کننده این ژن در شکل 2-2 آورده شده است. مناطق کد کننده به صورت رنگی نمایش داده شدهاند.
شکل 2-1 منطقه کد کننده پروتئین ژن calcineurin B-like protein 4 (CBL4) در رقم Clipper جو
Hordeum vulgare subsp. vulgare cultivar Clipper calcineurin B-like protein 4 (CBL4) gene,complete cds
join(345..429,523..605,698..866,1011..1063,1169..1249,
1523..1635,1865..1937)
/gene=”CBL4″
/codon_start=1
/product=”calcineurin B-like protein 4″
/protein_id=”ADW08757.1″
/db_xref=”GI:320090215″
/translation=”MGCVSSSPGRSRRAPGYEDPAVLASQTSFTVNEVEALYELYKKL
SYSIFKDGLIHKEEFQLALFRTSKGPSLFADRVFDLFDLKRNGVIEFGEFVRSLSIFH
PKAPESDKAAFAFKLYDLRGTGYIEKEELRELVVALLDESDLCLSDSAVEEIVDNTFS
QADSNGDDRIDPKEWEEFVKKNPASLRNMSLPYLQDITTAFPSFVMHSEVDDYSGISK
شکل2- 2 توالی کامل ژن CBL4 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن
مدل ژنی ژن HKT1 در شکل 2-3 نشان داده شده است. توالی مناطق کدکننده و غیرکدکننده ژن HKT1 در شکل 2-4 آمده است.
شکل 2-3 مدل ژنی ژن HKT1
Hordeum vulgare mRNA for high-affinity sodium transporter (HKT1 gene)
شکل 2- 4 توالی کامل ژن HKT1 و مشخصات منطقه کد کننده و توالی آمینو اسیدی در این ژن.
2-5 مشخصات پرایمرهای طراحی شده
برای هر یک از ژنهای CBL4 و HKT1 چهار پرایمر طراحی گردید که مشخصات آنها در جدول 2-1 ارائه شده است.
جدول 2-1 نام و توالی پرایمرهای طراحی شده برای ژنهای HKT1 و CBL4
شماره نام طول تخمینی قطعات تکثیری (bp) توالی (5´ _ 3´)
1 CBL4-1 560 F: ATGGGTGGTTGTGTTTCTGTTAG R: AGAGGTCGAACACCCTGTCG
2 CBL4-2 630 F: CCTCAACTCATCTCATCTCATCTG
R: GATCTCCTCAACGGCGCTAT
3 CBL4-3 560 F: GAACTTCGGTTAACTGATTGCAT
R: CGGCAGATAAGTACTCACTGAAGA
4 CBL4-4 490 F: GAATGGCGATGACAGGATAGAC
R: GAGCTCCGGATTTTCGAGGT
5 HKT1-1 560 F: ACTCATATATAGCACCATGGGTTG
R: CCCTGTACATTTCTTGGGTGTAAT
6 HKT1-2 560 F: AAGAGTGAAGATCAGCTCAGTTCC
R: CCTAGGAAGCAGATTACCAAAATG
7 HKT1-3 560 F: ATTGTTCCCTCTCTTCCTTAGGTT
R: AGGTTGAGAAGTTGAGTGGATCAT
8 HKT1-4 490 F: AAGCCAAGAGAGGGTCGTTG
R: AGCGCAACATCCACAAACTATAAC
2-6 تهیه نمونه DNAی ژنومی
برای تهیه نمونه DNAی ژنومی، برگهای تازه گیاه از گیاهچههای 14 روزه گیاه جو جدا شده و به مدت 3 روز در دستگاه Dryfreez قرار داده شدند تا آب میان بافتی آنها کاملاً خشک شود. سپس نمونههای برگی با دستگاه گریندر کاملاً پودر شده و برای استخراج DNA آماده شدند. DNAی ژنومی از نمونه گیاهی هر ژنوتیپ طبق روش سقائی و همکاران (1984) با اندکی تغییرات استخراج گردید.
27305698500
شکل 2- 5 گیاهچههای 14 روزه که برای تهیه نمونه برگی استفاده شدند.
-2228852126615شکل 2-7 دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونههای برگی
00شکل 2-7 دستگاه گریندر برای پودر کردن نمونههای برگی
29457651755140شکل 2-6 دستگاه Freezdryer برای خشک کردن
نمونههای برگی
00شکل 2-6 دستگاه Freezdryer برای خشک کردن
نمونههای برگی
3105785-3175000-241300-3175000
2-7 تعیین کیفیت و کمَیَت نمونه های DNA
کیفیت و کمَیَت نمونه DNA های استخراج شده روی ژل آگارز 1% تعیین گردید. برای تعیین کیفیت DNA، یک میکرولیتر از DNAی ژنومی هر نمونه گیاهی همراه با 2 میکرولیتر بافر لود کننده روی ژل آگارز لود شد. برای تعیین کمَیَت DNA از DNAی لامبدا استفاده گردید. صد نانوگرم از آن در یک سمت ژل و 200 نانوگرم در سمت دیگر ژل همراه با نمونههای DNA استفاده گردید. سپس از روی تصاویر ژل و با توجه به وضعیت DNAی لامبدا روی آن، غلظت نمونههای DNA تخمین زده شد. شکل 2-8 تصویر ژل نمونههای DNAی استخراج شده را نشان میدهد. پس از تعیین غلظت استوکهای DNA، نمونههای رقیق شده DNA با غلظت 15 نانوگرم در میکرولیتر تهیه شد. برای رقیق کردن استوک DNA میتوان از آب استریل دوبار تقطیر و یا بافر 1/0 TE استفاده کرد اما برای توالییابی بهتر است از نمونه DNAهایی که با آب مقطر رقیق شدهاند استفاده نمود (زیرا بافر TE موجب ایجاد برخی اختلالات در دنیچره شدن دو رشته DNA در محصول PCR میگردد).
30226038227000505650538227000 لامبدای 200 نانوگرم لامبدای 100 نانوگرم
-28638525209500
-523811527559000-39528751031240شکل 2-8 تصویرژل نمونههای DNA
00شکل 2-8 تصویرژل نمونههای DNA
-8
2-8 واکنش زنجیرهای پلیمراز برای تست پرایمرها
مناطق ژنومی محدود به توالی فوروارد و ریورس هر جفت پرایمر از طریق واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) تکثیر شده و محصولات PCR روی ژل آگارز مورد ارزیابی قرار گرفتند. مقادیر مواد مورد نیاز برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز در جدول 2-2 آورده شده است. این مواد از جمله بافر PCR، dNTP، MgCl2 و آنزیم DNA تک پلیمراز از شرکت فرمنتاز تهیه شدهاند. پرایمرهای مورد استفاده در این آزمایش از شرکت WMG تهیه گردیدند. برای تکثیر قطعات ژنومی مورد نظر ابتدا یک چرخه دمایی 94 درجه سانتی گراد به مدت 5 دقیقه، سپس 10 چرخه دمایی شامل، دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 68 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد برای یک دقیقه اعمال گردید که در هر چرخه یک درجه دمای انلینگ (68 درجه) کاهش یافته و پس از چرخه دهم این دما به 58 درجه سانتی گراد تقلیل یافت. سپس 35 چرخه شامل دمای 94 درجه سانتی گراد به مدت 30 ثانیه، 58 درجه سانتی گراد 30 ثانیه و 72 درجه سانتی گراد به مدت 2 دقیقه اعمال گردید. در انتها 5 دقیقه در دمای 72 درجه سانتی گراد قرار داده شد تا تکثیر قطعات تکمیل گردد. دستگاه PCR مورد استفاده در این آزمایش مدل ABI Vertri 96 بوده است. ABI Vertri 96 Thermal CyclerABI Vertri 96 Thermal Cycler ABI Vertri 96 Therm
3114675427990شکل 2-9 دستگاه ترموسایکلر مدل
ABI Vertri 96
00شکل 2-9 دستگاه ترموسایکلر مدل
ABI Vertri 96
78105-19050000
جدول 2-2 مواد مورد نیاز برای واکنش PCR
مواد مورد نیاز PCR میزان مواد مورد نیاز (میکرولیتر)
DNA 1
بافر ا
dNTPs 1 میکرولیتر
پرایمر فوروارد 5/0 (غلظت 5 پیکومول)
پرایمر ریورس 5/0 (غلظت 5 پیکومول)
آنزیم تک پلیمراز 1/0
MgCl2 6/0
آب مقطر 3/5
حجم نهایی 10
2-9 آزمون کارآیی پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن تنوع تک نوکلئوتیدی
برای آزمون قابلیت پرایمرهای طراحی شده برای نشان دادن پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی (SNP) در ژن های مورد مطالعه، قطعات ژنی مورد نظر در تعداد محدودی ژنوتیپ (4 ژنوتیپ) تکثیر شده و سپس وجود تنوع تک نوکلئوتیدی در این قطعات از طریق توالییابی مورد بررسی قرار گرفت. برای اطمینان کامل از نتایج توالییابی، هر دو پرایمر فوروارد و ریورس در واکنشهای جداگانه برای تکثیر یک قطعه مورد نظر و سپس توالی یابی آن قطعه استفاده شدند. در نهایت، نتایج این توالی ها با توالی اصلی ژن که در GeneBank گزارش شده (توالی هایی که پرایمرها از روی آنها طراحی شدند)، مقایسه گردیدند. توالی یابی به کمک دستگاه ABI 3100 انجام گرفته است. قطعات ژنی تکثیر شده توسط پرایمرها، روی ژل آگارز 2/1 درصد تست گردیدند. شکل 2-10 محصول PCR چهار ژنوتیپ که هر یک با 5 پرایمر روی ژل آگارز مورد آزمایش قرار گرفتهاند را نشان میدهد.
125476017589500130365524765پرایمر 1
00پرایمر 1