– (54)

Please enter banners and links.

فصل دوم: کلیات و مرور منابع………………………………………………………………………………………………………………….. 5
2-1- کلیات………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 5
2-1-1- ترکیبات شبه آندروژنی………………………………………………………………………………………………………………. 10
2-1-2- ترکیبات شبه استروژنی……………………………………………………………………………………………………………….. 10
2-1-3- اثرات زیستی ترکیبات مخرب سیستم درونریز (ترکیبات شبه استروژنی)…………………………………………….. 11
2-1-3- الف- ویتلوژنین و سایر پروتئینهای تولیدمثلی مخصوص جنس ماده…………………………………………………… 11
2-1-3- ب- مطالعات فیزیولوژیک و رفتاری…………………………………………………………………………………………….. 13
2-1-3- ج- شاخصهای وضعیت……………………………………………………………………………………………………………. 14
2-2- مرور منابع…………………………………………………………………………………………………………………………………… 14
2-2-1- فراسنجههای خونی……………………………………………………………………………………………………………………. 14
2-2-2- بافتشناسی گناد، GSI و نسبت جنسی………………………………………………………………………………………….. 15
2-2-3- تولید ویتلوژنین و ارزیابی بیان نسبی آن…………………………………………………………………………………………… 16
فصل سوم: مواد و روشها……………………………………………………………………………………………………………………….. 18
3-1- معرفی گونه مورد مطالعه…………………………………………………………………………………………………………………. 18
3-2- ایستگاههای نمونه برداری………………………………………………………………………………………………………………… 19
3-3- زیستسنجی…………………………………………… …………………………………………………………………………………… 20
3-4- فراسنجههای خونی………………………………………………………………………………………………………………………… 20
3-4-1- اندازهگیری هموگلوبین………………………………………………………………………………………………………………. 20
3-4-2- اندازهگیری هماتوکریت………………………………………………………………………………………………………………. 21
3-4-3- شمارش گلبولهای قرمز……………………………………………………………………………………………………………… 21
3-4-4- شمارش گلبولهای سفید……………………………………………………………………………………………………………… 22
3-4-5- شمارش افتراقی گلبولهای سفید…………………………………………………………………………………………………… 23
3-4-6- شاخصهای ثانویه خونشناسی……………………………………………………………………………………………………… 23
3-4-6- الف- حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)……………………………………………………………………………………… 23
3-4-6- ب- میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC)…………………………………………………………………………… 23
3-4-6- ج- میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH)………………………………………………………………………………………… 23
2163445271780هشت
00هشت
3-5- تعیین سن……………………………………………………………………………………………………………………………………… 24
3-6- محاسبه شاخص توسعه گنادی (GSI)………………………………………………………………………………………………… 24
3-7- تهیه بافت گناد……………………………………………………………………………………………………………………………….. 24
3-8- آمادهسازی نمونهها جهت مطالعات مولکولی و اندازهگیری بیان ژن ویتلوژنین……………………………………………. 24
3-8-1- نمونهبرداری و تیمار…………………………………………………………………………………………………………………… 25
3-8-2- استخراج و تعیین کمیت و کیفیت RNA………………………………………………………………………………………… 25
3-8-3- سنتز cDNA……………………………………………………………………………………………………………………………. 26
3-8-4- همسانهسازی cDNA نسبی ویتلوژنین در Petroleuciscus esfahani……………………………………………… 26
3-8-5- همسانهسازی cDNA نسبی بتا-اکتین در P. esfahani……………………………………………………………………. 27
3-8-6- بسط ویتلوژنین به سمت انتهای َ3…………………………………………………………………………………………………… 27
3-8-7- تکثیر سریع دوانتهای cDNA (RACE) در ویتلوژنین………………………………………………………………………. 28
3-8-8- تکثیر سریع دوانتهای cDNA در بتا-اکتین……………………………………………………………………………………… 28
3-8-9- آنالیز توالیها…………………………………………………………………………………………………………………………….. 28
3-8-10- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود……………………………………………. 29
3-8-11- اندازهگیری بیان ژن از طریق PCR کمی (QPCR) رونوشت معکوس………………………………………………. 29
3-9- مقایسات آماری……………………………………………………………………………………………………………………………. 32
فصل چهارم: نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………………………… 33
4-1- شاخصهای زیستی ماهیان صید شده………………………………………………………………………………………………….. 33
4-2- ویژگیهای فیزیکوشیمیایی آب در ایستگاههای نمونهبرداری………………………………………………………………….. 34
4-3- فراسنجههای خونی………………………………………………………………………………………………………………………… 35
4-4- شاخص توسعه گنادی، بافتشناسی گناد و نسبت جنسی………………………………………………………………………… 39
4-4-1- شاخص توسعه گنادی…………………………………………………………………………………………………………………. 39
4-4-2- مطالعه میکروسکوپی توسعه گنادی……………………………………………………………………………………………….. 41
4-4-3- نسبتجنسی……………………………………………………………………………………………………………………………… 43
4-5- مطالعات مولکولی………………………………………………………………………………………………………………………….. 45
4-5-1- تعیین کمیت و کیفیت RNA……………………………………………………………………………………………………….. 45
4-5-2- توالی کامل cDNA ویتلوژنین در Petroleuciscus esfahani……………………………………………………….. 49
4-5-3- توالی کامل cDNA بتا-اکتین در P. esfahani……………………………………………………………………………… 52
4-5-4- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود……………………………………………… 54
4-5-5- اندازهگیری بیان ژن ویتلوژنین………………………………………………………………………………………………………. 56
2266315304800نه
00نه
فصل پنجم: نتیجهگیری کلی و پیشنهادها……………………………………………………………………………………………………… 60
5-1- نتیجهگیری……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 60
5-2- پیشنهادها…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….. 61
منابع……………………………………………………………………………………………………………………………………………………. 62
26555706873875ده
00ده
26543008084185ده
00ده

فهرست اشکال
عنوان صفحه
شکل 2-1- ساختار شیمیایی برخی از ترکیبات مخرب سیستم درونریز……………………………………………………………. 7
شکل 2-2- نمودار شماتیک از محور HPG در ماهیان………………………………………………………………………………….. 9
شکل 2-3- مسیرهای اصلی عملکرد ترکیبات شبهاستروژنی موجود در محیط……………………………………………………. 12
شکل 2-4- مکانیسم اثر هورمون استرادیول در تولید VTG و Zrp در ماهیان……………………………………………………. 13
شکل 3-1- عروسماهی زایندهرود صید شده از رودخانه زاینده رود…………………….. ………………………………………… 18
شکل 3-2- موقیعت جغرافیای ایستگاههای نمونهبرداری………………………………………………………………………………… 19
شکل 3-3- ایستگاه چمگردان………………………………………………………………………………………………………………….. 20
شکل3-4- خونگیری از ساقه دمی عروسماهی زایندهرود…………………………………………………………………………….. 21
شکل 3-5- لام هماسیتومتر………………………………………………………………………………………………………………………. 22
شکل 4-1- ساختار ماکروسکوپی بیضه و تخمدان در عروسماهی زایندهرود…………………………………………………….. 39
شکل 4-2- مقایسه میانگین GSI جنس نر عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف……………………………………. 40
شکل 4-3- مقایسه میانگین GSI جنس ماده عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف………………………………… 40
شکل 4-4- تصویر گناد جنس ماده در ایستگاه خرسونک و چمگردان…………………………………………………………….. 43
شکل 4-5- نمودار ترسیم شده توسط دستگاه بیوآنالیزور برای نمونه RNA شماره 5 متعلق به ایستگاه چشمهدیمه…….. 48
شکل4-6- توالی نوکلئوتید و آمینواسید ویتلوژنین در P. esfahani……………………………………………………………….. 51
شکل4-7- توالی نوکلئوتید و آمینواسید بتا-اکتین در P. esfahani………………………………………………………………. 53
شکل 4-8- آنالیز فیلوژنیکی توالیهای پروتئین ویتلوژنین در P. esfahani و سایر مهرهداران……………………………… 55
شکل 4-9- منحنی استاندارد غلظتهای مختلف cDNA ویتلوژنین در QPCR………………………………………………… 56
شکل 4-10- منحنی استاندارد غلظتهای مختلف cDNA بتا-اکتین در QPCR……………………………………………….. 56
شکل 4-11- مقایسه میانگین بیان ژن VTG در جنس ماده عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف……………… 57
شکل 4-12- مقایسه میانگین بیان ژن VTG در جنس نر عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف…………………. 58
25844502302510یازده
00یازده

فهرست جداول
عنوان صفحه
جدول 2-1- معرفی برخی از EDCها به همراه برخی منابع تولیدکننده و اثرات احتمالی آنها بر زیستمندان……………… 6
جدول 3-1- محل و موقعیت جغرافیایی صید عروسماهی زایندهرود…………………………………………………………………. 20
جدول 3-2- اولیگونوکلئوتیدهای طراحی شده برای حصول قطعات مورد نظر در ویتلوژنین و بتا-اکتین…………………… 31
جدول 4-1- ویژگیهای زیستی ماهیان صید شده در ایستگاههای نمونهبرداری رودخانه زایندهرود…………………………. 34
جدول 4-2- ویژگیهای فیزیکوشیمیایی آب در ایستگاههای نمونهبرداری………………………………………………………….. 35
جدول 4-3- میانگین برخی از فاکتورهای خونی در عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف………………………… 36
جدول 4-4- میانگین شاخصهای محاسبهای گلبولهای قرمز در عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف……….. 37
جدول 4-5- میانگین درصد گلبولهای سفید مشاهد شده در عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف ……………. 38
جدول 4-6- قطر تخمک در ماهیان صید شده در ایستگاههای مختلف نمونهبرداری……………………………………………… 42
جدول 4-7- نسبت جنسی ماهیان صید شده در ایستگاههای مختلف نمونهبرداری…………………………………………………. 44
جدول 4-8-کمیت و کیفیت نمونههای RNA………………………………………………………………………………………………. 46
جدول 4-9- میزان شباهت توالی کامل نوکلئوتید ویتلوژنین در P. esfahani با برخی دیگر از گونهها……………………. 49
جدول 4-10- میزان شباهت توالی کامل آمینواسید ویتلوژنین در P. esfahani با برخی دیگر از گونهها………………….. 49
جدول 4-11- میزان شباهت توالی کامل نوکلئوتید بتا-اکتین در P. esfahani با برخی دیگر از گونهها………………….. 52
جدول 4-12- میزان شباهت توالی کامل آمینواسید بتا-اکتین در P. esfahani با برخی دیگر از گونهها………………….. 52
26155653797300دوازده
00دوازده

-420370-69088000
چکیده
از جمله آلایندههای محیط زیست ترکیبات مخرب سیستم اندوکراینی هستند که از منشا طبیعی یا انسانساز وارد محیط زیست خصوصاً اکوسیستمهای آبی شده و با ایجاد اختلال بر سامانه غدد درونریز، اثرات مخربی را بر جوامع زیستی این اکوسیستمها وارد مینمایند. هدف از انجام این تحقیق، ارزیابی برخی از شاخصهای زیستی عروسماهی زایندهرود Petroleuciscus esfahani، نظیر مقایسه فراسنجههای خونی، نسبت جنسی، شاخص توسعه گنادی و بیان ژن ویتلوژنین در کبد ماهیان صید شده از ایستگاههای مختلف رودخانه زایندهرود است. نمونهبرداری از چهار ایستگاه چشمهدیمه و خرسونک (در بالادست رودخانه به عنوان ایستگاههای پاک) و چمگردان و پل صفائیه (در پاییندست رودخانه به عنوان ایستگاه آلوده) صورت گرفت. در این مطالعه در مجموع 323 قطعه ماهی صید شد. میانگین وزنی و طولی ماهیان به ترتیب معادل 93/14 گرم و 96 میلیمتر بود. در مقایسه فراسنجههای خونی، تعداد کل گلبولهای قرمز، میزان هموگلوبین و هماتوکریت و تعداد کل گلبولهای سفید تفاوت معنیداری را بین ماهیان ایستگاههای مختلف نشان نداد. با این وجود در شمارش افتراقی گلبولهای سفید، درصد انواع گلبولهای سفید به جز لنفوسیتها در ماهیان ایستگاه چمگردان نسبت به ماهیان سایر ایستگاهها بالاتر بود (05/0p<). شاخصهای ثانویه خونشناسی نظیر حجم متوسط گویچه قرمز، میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای و میانگین هموگلوبین ذرهای در ایستگاه چمگردان کمتر از مقادیر متناظر در سایر ایستگاهها بود (05/0p<). در مطالعه نسبت جنسی ماهیان مشخص گردید که در تمامی ایستگاهها به جز ایستگاه پل صفائیه انحراف معنیداری از نسبت مورد اننظار (1:1) (با فراوانی بیشتر جنس ماده) وجود دارد (آزمون مربع کای؛ 05/0p<). با این وجود در مطالعه میکروسکوپی گنادها، نشانی از بروز ناهنجاریهای گنادی نظیر جنسیت بینابینی مشاهده نشد. شاخص توسعه گنادی (GSI) در ماهیان نر و ماده محاسبه شد. مقایسه آماری این شاخص تنها کاهش معنیدار آن را در جنس نر ماهیان ایستگاه چمگردان با ماهیان سایر ایستگاهها نشان داد (05/0p<). بیان ژن ویتلوژنین در کبد عروسماهی زایندهرود به عنوان شاخص زیستی معتبری برای وجود آلایندههای مخرب سیستم اندوکراینی با فعالیت شبهاستروژنی در منابع آبی مدنظر قرار گرفت. به این منظور ابتدا نسبت به توالییابی کامل ژن ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود اقدام شد. نتایج نشان داد که ژن کدکننده ویتلوژنین در این گونه دارای 4177 جفتباز است که پروتئینی حاوی 1776 آمینواسید را تولید میکند. بررسی شدت بیان ژن ویتلوژنین در جنس نر و ماده عروسماهی زایندهرود در ایستگاههای مختلف به روش Real-time PCR و با استفاده از ژن کنترل داخلی بتا-اکتین نشاندهنده وجود بیان نسبی در هر دو جنس در تمامی ایستگاههای مورد بررسی است. شدت بیان در ایستگاههای مختلف تفاوت معنیداری را نشان داد بهطوریکه میزان بیان نسبی ویتلوژنین در ماهیان چمگردان در هر دو جنس بهطور معنیداری نسبت به سایر ایستگاهها بالاتر بود (05/0p<). بهطور کلی نتایج این تحقیق بیانگر اثرات احتمالی ترکیبات مخرب سیستم اندوکراینی با خاصیت شبهاستروژنی بر برخی ویژگیهای زیستی عروسماهی زایندهرود نظیر انحراف از نسبت جنسی (فراوانی بیشتر جنس ماده) و بیان ژن ویتلوژنین در جنس نر و تغییر بیان آن در ماهیان ایستگاههای مختلف رودخانه زایندهرود بود.
واژگان کلیدی: ترکیبات مخرب سیستم درون ریز، عروسماهی زایندهرود Petroleuciscus esfahani، خونشناسی، بافتشناسی گناد، بیان ویتلوژنین. -198120-52260500
-210185-171958000 فصل اول
مقدمه
طی دو دهه اخیر، موضوع حفاظت از محیط زیست در مقابل آلایندههای طبیعی یا مصنوعی حاصل از فعالیتهای انسان، توجه و نگرانیهای زیادی را با خود به همراه داشته است [18]. این نگرانیها موجب ایجاد علاقه در بسیاری از دولتها، سازمانهای بینالمللی، جوامع علمی، صنایع شیمیایی و عموم مردم برای تشکیل برنامهها، کنفراسها و کارگاههای تحقیقاتی در مورد موضوعات مربوط به ترکیبات مخرب سیستم درونریز (EDCها)[1] گردیده است. ترکیبات مخرب سیستم درونریز ماده یا ترکیبی از مواد هستند که عملکرد (های) سیستم درونریز را تغییر میدهند و در نتیجه موجب اثرات متعدد بر سلامت یک جاندار سالم، دودمان و یا (زیر) جمعیتی از آن میشوند [32]. به عبارت دیگر هر ترکیبی که در تولید، ترشح، انتقال، اتصال، عملکرد و یا حذف هورمونهای طبیعی بدن مداخله کند و باعث تغییر وظایف طبیعی آنها همچون نمو، رفتار، باروری، بقا و همئوستازی شود را ترکیب مخرب سیستم درونریز مینامند. این ترکیبات میتوانند باعث ایجاد تومورهای سرطانی، نقایص مادرزادی و سایر ناهنجاریهای توسعهای شوند. از جمله این ناهنجاریها میتوان به ناتوانی در یادگیری، مشکلات حاد در توجه و شناخت، توسعه مغزی، بدشکلی در بدن، توسعه اندامهای تولیدمثلی، مادهسازی در جنس نر یا اثرات مردانه بر جنس ماده اشاره کرد [23].
EDCها ممکن است به صورت طبیعی و یا در اثر فعالیتهای انسانی تولید شوند و شامل گروههای مختلفی از مواد شیمیایی از قبیل هورمونهای طبیعی و ساختگی، اجزاء گیاهی، آفتکشها، ترکیبات مورد استفاده در صنعت پلاستیک سازی و محصولات مربوط به بهداشت فردی و سایر محصولات و آلایندههای جانبی حاصل از صنایع هستند. برخی از
این ترکیبات چربیدوست و بنابراین پایا هستند و میتوانند مسافتهای طولانی بین مرزهای طبیعی جابجا شوند اما برخی دیگر آبدوست هستند و به سرعت در محیط یا در بدن انسان تجزیه میشوند و ممکن است تنها در دورهای کوتاه اما بحرانی از توسعهی سیستمهای بدنی حضور داشته باشند [26].تنوع بسیار زیاد ویژگیهای فیزیکوشیمیایی EDCها به این معنی است که ممکن است این ترکیبات تجزیه شوند و اثرات آنها به اشکال مختلف بروز نماید. به علاوه، گستره پراکنش این ترکیبات در محیط بسیار وسیع است و شامل هوا، آب، خاک، رسوبات، غذا و محصولات مصرفی میشود. جذب EDCها از طریق غذا، اصلیترین مسیر در معرض قرارگیری انسان و بیشتر جانوران است که میتواند به تجمع و بزرگنمایی زیستی[2] منجر شود [26، 52].
از آنجاییکه مقصد نهایی بیشتر آلایندهها، محیطهای آبی هستند، موجودات آبزی به ویژه ماهیان بیشتر از سایر زیستمندان در معرض این ترکیبات قرار دارند. روزانه حجم زیادی از پسابهای شهری و صنعتی به رودخانهها و آبهای نزدیک سواحل دریاها میریزند. البته بسیاری از مواد شیمیایی نیز بهطور تصادفی از زمینهای اطراف شسته و وارد این محیطها میگردند [99]. به علاوه بیشتر EDCها به ندرت به ذرات موجود در آب متصل میشوند و بنابراین به آسانی در دسترس آبزیان قرار میگیرند [55]. از میان EDCها، گروهی از هورمونها که به نظر میرسد بیشترین قابلیت عملکرد به عنوان ترکیبات فعال درونریز را داشته باشند، استروئیدهای جنسی هستند و بیشتر تحقیقات انجام شده در این رابطه بر ترکیبات استروژنی متمرکز بوده است. آنالیز شیمیایی آب و رسوبات به علت گران بودن و طیف گسترده این ترکیبات، روش کارآمدی برای شناسایی آنها نیستند. بنابراین شاخصهای زیستی حساس بسیاری به منظور پایش این ترکیبات ایجاد شدهاند. یکی از مهمترین شاخصهای ترکیبات استروژنی در محیط، القاء سنتز ویتلوژنین (VTG)[3] در جنس نر یا افراد نابالغ است [18]. از دیگر شاخصهای زیستی مورد استفاده در تعیین اثرات EDCها میتوان به مطالعات رفتاری و فیزیولوژیک از قبیل بررسی بافتشناسی و برخی از شاخصهای گنادی درماهیان اشاره کرد [49].
رودخانه زایندهرود به عنوان بزرگترین و مهمترین رودخانه مرکزی ایران از ارتفاعات زردکوه بختیاری سرچشمه میگیرد و با ورود به استان اصفهان در جهت شرق جریان یافته و به تالاب گاوخونی واقع در جنوب شرقی استان منتهی میشود. در حدود 65 درصد از واحدهای صنعتی بزرگ استان در حاشیه رودخانه زایندهرود قرار گرفتهاند و علیرغم تلاشهای به عمل آمده در جهت استقرار سیستمهای تصفیه پساب در این صنایع، فعالیت آنها توأم با آلودگی های زیست محیطی است [5]. به علاوه با توجه به نحوه کاربری اراضی در حاشیه این رودخانه (زمینهای کشاورزی، واحدهای دامداری و دامپروری، صنایع کوچک تا صنایع مادر از قبیل کارخانههای فولاد و ذوبآهن و همچنین حضور چندین کارخانه تصفیه فاضلاب) به نظر میرسد این اکوسیستم در معرض انواع مختلف از ترکیبات مخرب سیستم درونریز قرار داشته باشد اما تاکنون هیچ مطالعهای در رابطه با اثر این ترکیبات بر سلامت این اکوسیستم مهم آبی صورت نگرفته است.
اهداف این مطالعه:
تعیین حضور و اثرات ترکیبات مخرب سیستم درونریز در اکوسیستم رودخانه زایندهرود با استفاده از بررسی سه ویژگی زیستی زیر در عروسماهی زایندهرود Petroleuciscus esfahani:
1- فراسنجههای خونی
2- شاخص توسعه گنادی (GSI)[4]، بافتشناسی گناد و نسبت جنسی
3- بیان ویتلوژنین در کبد دو جنس نر و ماده
-88265-45466000
فصل دوم
-488315-227711000کلیات و مرور منابع
2-1- کلیات
نگرانی از وجود آلایندهها در محیط زیست خصوصاً منابع آبی و اثرات مخرب آنها بر حیات وحش و انسان روز به روز در حال گسترش است. متاسفانه در اکثر مناطق جهان، حتی کشورهای توسعه یافته، گستره وسیعی از آلایندههای زیست محیطی بدون حداقل بهبود و پایش وارد منابع آبی میشوند. از جمله مهمترین انواع آلایندههای زیست محیطی، ترکیبات مخرب سیستم درونریز است. این ترکیبات طیف وسیعی از مواد طبیعی و مصنوعی مورد مصرف در فعالیتهای مختلف انسانی اعم از صنایع مادر نظیر فولاد و کاغذسازی تا فعالیتهای مرسوم کشاورزی و دامپروری را در بر میگیرند. بخش زیادی از این ترکیبات ناشی از فاضلابهای شهری و خانگی است (جدول 2-1 و شکل 2-1).
مطالعات موجود در رابطه با انسان نشان میدهد که حضور برخی از ترکیبات شیمیایی در محیط،کیفیت و کمیت اسپرم را کاهش و احتمال سقط جنین را افزایش میدهد. در بسیاری از مناطق صنعتی جهان، تغییر نسبت جنسی از 1:1 به نفع یکی از دو جنس نر یا ماده،کاهش سن بلوغ جنسی، افزایش مقطعی در فراوانی ناهنجاریهای توسعهای مجرای تولیدمثلی مردان، افزایش مشاهده برخی سرطانها در بافتهای هورمونی حساس از قبیل سینه، رحم، بیضه، پروستات و تیروئید را اغلب به عنوان شاهدی برای حضور گسترده EDCها و اثرات مختلف آنها بر سلامت انسان میدانند [26]. اما محدودیتهای بسیاری برای بررسی اثر این ترکیبات بر جوامع انسانی وجود دارد و بیشتر مطالعات در این رابطه بر گونههای آبزی متمرکز بوده است.
جدول 2-1) معرفی برخی از ترکیبات مخرب سیستم درونریز به همراه برخی منابع تولیدکننده و اثرات احتمالی آنها بر زیستمندان [54].
ترکیبات شبه آندروژنی منابع تولید اثرات احتمالی
زیستکش وینکلوزولینقارچکش
ضد آندروژن، کاهش وزن گناد نر
پسابهای صنعتی دیبوتیل فتالات
تولید پلاستک، چسب و رنگها
کاهش تولید و بیان ژن تستوسترون
ترکیبات گیاهی 3،3- دیایندولیل متاندر برخی از سبزیجات مثل کلم
ضد آندروژن
ترکیبات شبه استروژنی منابع تولید اثرات احتمالی
هورمونهای طبیعیاسترون (E1)[5]
17 بتا- استرادیول (E2)[6]
17 آلفا- استرادیول
هورمون طبیعی زنانههورمون طبیعی زنانههورمون طبیعی زنانهالقاء سنتز پروتئینهای جنس ماده
کاهش GSI، تغییر ریختشناسی بیضه
عدم ایجاد ضمائم ثانویه جنسی
دامپزشکی آلفا- زئارالانول[7]
محرک رشد
القاء سنتز ویتلوژنینفیتواسترولها بتا- سیتوسترول
استیگماستانول[8]
استرول گیاهی
استرول گیاهی
ضد استروژن، القاء رفتار جنسی مردانهضد استروژن، القاء رفتار جنسی مردانه
پسابهای صنعتی و شهری بیسفنولآنانیلفنولبیفنیلهایپلیکلرینه (PCBs)[9]هیدروکربنهای آروماتیک چندحلقهای(PAHs)[10]
آلکیل فنولهاتولید پلاستیک
مواد شوینده
وسایل الکترونیکی
انواع سوختها، برخی غذاها
تولید لاستیک، مواد آرایشی
جنسیت بینابینیجنسیت بینابینی
سرطانزاجهشزا، سرطانزا
القاء سنتز ویتلوژنینزیستکشها متوکسیکلرآترازین
آفتکش
آفتکش
ممانعت از اسپرماتوژنزیز
سرطانزاپزشکی دیاتیلاستیلبسترولاکوئیلین[11]
درمان سرطان
قرص ضد بارداری
سرطانزاالقاء سنتز ویتلوژنین
17 بتا- استرادیول بیسفنولآ[12] بیفنیلهایپلیکلرینه (PCBs)

نانیلفنول[13] متوکسیکلر[14] دیاتیلاستیلبسترول[15]

11- کتوتستوسترون وینکلوزولین[16] 3،3- دیایندولیل متان[17]
شکل2-1) ساختار شیمیایی برخی از ترکیبات مخرب سیستم درونریز [39].
مقصد نهایی بیشتر ضایعات، محیطهای آبی هستند و روزانه حجم زیادی از پسابهای شهری و صنعتی به رودخانهها و آبهای نزدیک سواحل دریاها میریزند [99]. بیشتر EDCها به ندرت به ذرات موجود در آب متصل میشوند و بنابراین به آسانی در دسترس موجودات آبزی قرار میگیرند و اثرات متعدی بر سلامت آنها ایجاد میکنند [55]. از جمله این اثرات میتوان به ایجاد حالت دوجنسی در شکمپایان دریایی درمعرض تریبوتیلتین (TBT)[18]، کاهش جمعیت خوکهای آبی دریای بالتیک از طریق مصرف طعمههای آلوده، نازک شدن پوسته تخم در پرندگان ماهیخوار که طعمه آنها در معرض DDTقرار داشتهاند و ناهنجاریهای گسترده در اندامهای جنسی تمساحهای ایالت فلوریدا آمریکا به دلیل حضور آلایندههای اورگانوکلرینی[19] اشاره کرد [28، 34، 41، 68].
از میان گونههای آبزی، سیستم درونریز ماهی از بسیاری جهات مشابه مهرهداران تکامل یافتهتر است و در نتیجه ماهیان این قابلیت را دارند که به عنوان شاخصهای زیستی تعیین اثرات EDCها بر سایر مهرهداران و حتی انسان به کار روند [18]. از سوی دیگر، تنفس آبی و تنظیم اسمزی از جمله عواملی است که باعث میشود ماهیان بیشتر در معرض این ترکیبات قرار گیرند. نرخ بالاتر تنفس ماهیان در مقایسه با انسان به علاوه سایر ویژگیهای آبشش ماهیان از قبیل جریان مخالف خون و آب، غشای نازک بافت پوششی و سطح وسیع آن میتواند جذب ترکیبات از آب و انتقال آنها به جریان خون را افزایش دهد [106]. ماهیان استخوانی آب شور به دلیل داشتن ویژگی هیپوتونیک[20]، آب دریا را مینوشند اما ماهیان آب شیرین، هیپواسموتیک[21] هستند و آب را به سمت بدن خود هدایت میکنند و ازاین طریق در معرض مواد موجود در آب قرار میگیرند [26]. بنابراین اثرات EDCها در جوامع ماهیان با سرعت بیشتری قابل تشخیص است. اگرچه در برخی از موارد، ماهیان از نظر ظاهری کاملا در سلامت هستند اما به دلیل حضور انواع آلایندهها از تنشهای فیزیولوژیک در رنج هستند. حضور مداوم این آلاینده های زیست محیطی میتواند منجر به ایجاد جنسیتهای بینابینی[22]، کاهش تراکم و تحرک اسپرم، کاهش اندازه گنادها، تغییر الگوی بیان ژن ویتلوژنین در انواع نر و ماده، انحراف نسبت جنسی و حتی نابودی کامل جمعیت ماهیان به عنوان جزئی از حیاتوحش رودخانه شود [56]. این تاثیرات به دلیل وجود کنشهای متقابل بین ترکیبات مخرب سیستم درونریز و این سیستم در آبزیان ایجاد میشود.
سه محور اصلی سیستم درونریز که توسعه و عملکرد تولیدمثلی را به عهده دارند، محورهای هیپوتالاموس- هیپوفیز- گناد (HPG)[23]، هیپوتالاموس- هیپوفیز- تیروئید (HPT)[24] و هیپوتالاموس- هیپوفیز- غدهی بینکلیه (HPI)[25] هستند که مهمترین آنها محور HPG هستند.
محور HPG از سه جزء اصلی تشکیل شده است (شکل 2-2): الف) هورمونهای آزاد کننده گنادوتروپین (GnRH)[26] ب) گنادوتروپهای موجود در بخش قدامی هیپوفیز که گنادوتروپینهای (GtH)[27] نوع اول و دوم را ترشح میکنند و ج) سلولهای سوماتیک گنادها (سلولهای تکا و گرانولوزا در تخمدان، سلولهای لایدیک و سرتولی در بیضه). GtH-। بر سلولهای تکا در جنس ماده و لایدیک در جنس نر و GtH-॥بر سلولهای گرانولوزا در جنس ماده و سرتولی در جنس نر اثر میگذارد. متعاقب آن، استروئیدهای جنسی گناد حاصل از اثر محرک GtH-। به همراه بازدارندهای پروتئینی حاصل از اثر GtH-॥، به جریان خون رها میشود و با ایجاد بازخور در گنادوتروپهای هیپوتالاموس و هیپوفیز باعث کاهش ترشح GnRH،GtH-। و GTH-॥ میشوند. در واقعیت مکانیسم عمل این محور بسیار پیچیدهتر است. مثلا اثرات GnRHبر ترشح GtH-। و GtH-॥اساسا با یکدیگر متفاوت است چراکه GtH-। به صورت شدید (در برهههای زمانی خاص) ولی GtH-॥ بسیار آهسته و طی چندین ساعت ترشح میشود [20، 24].
علاوه بر اینگونه پیچیدگیهای جزئی موجود در طرح اولیهی سیستم درنریز، فاکتورهای مهم دیگری نیز وجود دارد که باید مدنظر قرار گیرند. یکی از این فاکتورها، تنظیم میزان حساسیت سلولها نسبت به محرکها است. گنادوتروپها پاسخپذیری ثابتی به تحریکات GnRHو سلولهای هدف در گنادها پاسخپذیری ثابتی به تحریکات GtH-। و GtH-॥ ندارند. مثلا تواترهای غیرطبیعی ناگهانی یا مزمن GnRH یا ترکیبات مشابه آن، منجر به تخریب یا همئوستازی منفی گیرندههای آن در گنادوتروپها میشود و آنها را نسبت به تحریکات آتی مقاومتر مینماید.

شکل 2-2) نمودار شماتیک از محور HPG در ماهیان [26].
موضوع بسیار مهمی که سبب پیچیدگی بیشتر این محور میشود، نقش پروتئینهایی است که به استروئیدهای جنسی متصل میشوند. این پروتئینها شامل آلبومین و آلفا-فتوپروتئین[28] و گلبولین متصل به هورمونهای جنسی (SHBG)[29] در انسان است. تقریبا 97-98% از تستوسترون و E2 در گردش خون انسان به SHBG متصل و تنها 2-3% از آن آزاد و از نظر زیستی فعال است [83].
مورد دیگری که باعث پیچیدگی بیشتر محور HPG میشود، برهمکنشهای اجزاء برونریز و درونریز این محور است. مثلا تستوسترون تولید شده در سلولهای لایدیک بر سلولهای سرتولی مجاور اثر میگذارد. به نظر میرسد که این موضوع مهمترین نقش تستوسترون در جنس نر است چراکه اثرات آن بر سلولهای سرتولی، اصلیترین مسیری است که اسپرماتوژنزیز را پشتیبانی میکند [91]. اثرات مشابه در تخمدان نیز مشاهده میشود. آندروژنهای ساخته شده در سلولهای تکا، اثرات برونریزی را بر سلولهای گرانولوزای مجاور (فولیکولهای در حال توسعه) اعمال میکند. مهمترین نتیجهی در معرضقرارگیری سلولهای گرانولوزا با تستوسترون این است که این سلولها میتوانند این آندروژن را به E2 تبدیل کنند. قابلیت سلولها در بیان آروماتاز و یا 5آلفا-ردوکتاز[30] در تبدیل یک هورمون برونریز با اثر موضعی (تستوسترون) به یک هورمون درونریز (E2 یا دیهیدروتستوسترون (DHT)[31]) بسیار رایج است [92، 93].
GtH-। مسئول رشد گناد و تشکیل گامت و GtH-॥ در آزادسازی آن نقش دارد. بهطور کلی، تستوسترون اصلیترین آندروژن و E2 اصلیترین استروژن تولید شده در تمام مهرهداران است. اما بسیاری از ماهیان استخوانی نر، 11-کتوتستوسترون نیز تولید میکنند و این ترکیب، آندروژن اصلی درگردش در جنس نر بسیاری از گونهها است. ماهیان استخوانی ماده نیز تستوسترون تولید میکنند و حتی سطح درگردش این ترکیب میتواند به اندازه E2 نیز باشد [44].
استروئیدهای جنسی را می توان به دو دسته اصلی تقسیم نمود؛ ترکیبات شبهآندروژنی و ترکیبات شبهاستروژنی. در این بخش چگونگی فرایند اثربخشی این ترکیبات و اثرات مخرب آنها بیان میشود.
2-1-1- ترکیبات شبه آندروژنی
آندروژنها گروهی از هورمونها یا ترکیبات هستند که عمدتا رشد و توسعه سیستم تولیدمثلی نر را تحت تاثیر قرار میدهند. در حالیکه ضد آندروژنها، داروها یا ترکیباتی هستند که فعالیت هورمون آندروژن را متوقف میکنند. هورمون آندروژن اصلی در ماهیان 11-کتوتستوسترون است که قسمت عمده آن توسط بیضهها تولید میشود. از جمله نقش آندوژنها در بدن، تنظیم GnRH، اسپرماتوژنزیز، ایجاد رفتارهای طبیعی جنس نر، عملکرد طبیعی ضمایم و غدد جنسی و سایر اثرات غیر تولیدمثلی از قبیل عملکرد سیستم ایمنی، متابولیسم استخوان و توسعه ماهیچه است. ترکیبات شیمیایی شبه آندروژنی، از طریق اتصال به گیرندههای آندروژنی از آندروژنهای طبیعی تقلید می کنند و مسیرهای سیگنال دهنده سلولی را تحت تاثیر قرار میدهند [39].
اثرات کوتاه مدت حضور آندروژنها یا ضدآندروژنها بر ماهیان هنوز به طور کامل شناخته نشده است. هرچند نمونههایی از اثرات این ترکیبات شامل نرسازی کپورماهیان دنداندار (Cyprinodontidae) ماده در رودخانههایی که پساب کارخانههای تولید چوب و کاغذ را دریافت میکنند، است. این ویژگیهای نرینه شامل ایجاد باله مخرجی (گنوپودیوم) تغییر یافته در ماهیان باردار، رفتارهای جفتگیری شبیه به جنس نر، ایجاد ماهیان هرمافرودیت (وجود همزمان اووسیتهای زردهدار و کیستهای اسپرماتید و اسپرماتوزوا) است. در تحقیق دیگری که بر روی جنین مارماهی زندهزا (Zoarces viviparus) در معرض پساب حاصل از کارخانه تولید خمیر چوب انجام گرفت، مشاهده شد که نسبت جنسی به نفع جنس نر تغییر کرده است [63، 64].
در حال حاضر روشهای موجود برای تشخیص اثرات EDCها به ویژه برای آندروژنها ناکافی، محدود و اکثر تحقیقات انجام شده مربوط به اثرات استروژنها بر تولیدمثل است.2-1-2- ترکیبات شبه استروژنی استروژن نام گروهی از هورمون‌های جنسی مربوط به جنس ماده است که در رشد و توسعه ویژگیهای جنسی و روند تولید مثل در این جنس نقش اساسی دارد. شکل 2-3 برخی از مهمترین مسیرهای تاثیر ترکیبات شبه استروژنی بر سیستم درونریز را نشان میدهد. بررسی ادرار زنان نشان می دهد که هر زن میتواند روزانه حدود 7 میکروگرم E1، 4/2 میکروگرم E2 و 6/4 میکروگرم استریول (E3)[32] دفع کند. از سوی دیگر، کاربرد زیاد قرصهای جلوگیری از بارداری که حاوی ترکیبات استروژنی هستند نیز مقادیر زیادی از این ترکیبات را وارد سیستم فاضلاب میکند. بنابراین به نظر میرسد که کارخانههای تصفیه فاضلاب یکی از منابع اصلی این نوع آلایندهها هستند چرا که این ترکیبات توسط فرایندهای مرسوم تصفیه جدا یا تجزیه نمیشود [51]. توانایی این هورمونهای استروژنی 10 تا 100 برابر بیشتر از ترکیبات شبه هورمونی است [39]. پساب ناشی از فعالیتهای کشاورزی و دامپروری نیز از منابع بالقوه ایجاد ترکیبات شبه استروژنی هستند. جدول 2-1 برخی از این ترکیبات به همراه کاربرد و تعدادی از اثرات احتمالی آنها را نشان میدهد.
مطالعات انجام شده نشان دادهاند که عوارض حاد ناشی از حضور ترکیبات شبهاستروژنی شامل ایجاد جنسیت بینابینی، کاهش تحرک اسپرم، کاهش جمعیت ماهیان، کاهش اندازهی گناد و انحراف نسبت جنسی به نفع ماده است. درحالیکه ازجمله عوارض حضور کوتاهمدت این ترکیبات میتوان به تولید ویتلوژنین در جنس نر و یا تغییر الگوی تولید آن در جنس ماده اشاره کرد [54].بهطور کلی اختلال در تولیدمثل طبیعی ماهی توسط استروژنها در مراحل لاروی و جنینی از طریق سنتز تعداد غیر طبیعی گیرنده استروژنی و در مراحل بالاتر چرخه زندگی از طریق تحریک گیرندههای استروژنی در ماهیان ماده بالغ یا نابالغ در زمانهای نامناسب و یا ماهیان نر بالغ یا نابالغ ایجاد میشود [39].
2-1-3- اثرات زیستی ترکیبات مخرب سیستم درونریز (ترکیبات شبه استروژنی)
آنالیز شیمیایی آب و رسوبات به علت گران بودن و طیف گستردهی EDCها، روش کارآمدی برای شناسایی این ترکیبات نیستند. بنابراین استفاده از ویژگیهای فیزیولوژیکی گونهها نه تنها میتواند نمایانگر اختلال در سیستم درونریز و سلامت تولیدمثلی ماهی باشد، بلکه میتواند تصویر روشنی از اثرات این ترکیبات در سطح موجود زنده فراهم آورد. شاخصهای زیستی در مطالعات صحرایی ابزارهای نیرومندی در ردیابی اثرات یک ماده یا ترکیبی از مواد هستند [49]. شاخصهای زیستی اینچنین تعریف شدهاند: “تغییر در پاسخ بیولوژیکی (اعم از پاسخهای مولکولی، سلولی و فیزیولوژیک) که میتوانند در ارتباط با حضور یا اثرات سمی ترکیات شیمیایی در محیط زیست باشند” [78].
الف- ویتلوژنین و سایر پروتئینهای تولیدمثلی مخصوص جنس ماده
در بدن ماهیان، هیپوتالاموس که به محرکهای محیطی حساس است و از این طریق به همزمانی چرخه تولیدمثلی در فصل مناسب کمک میکند، با هورمونهای تولیدی خود هیپوفیز را تحت تاثیر قرار میدهد و موجب ترشح هورمونهای گنادوتروپین از آن میگردد (شکل 2-4). این هورمونها بر تخمدان اثر میکند و سبب تولید E2 از آن میشوند. این هورمون به گیرندههای خود در کبد متصل و سبب سنتز پروتئینهای مهم تولید مثلی از قبیل ویتلوژنین و پروتئین زونارادیاتا (Zrp)[33] موجود در پوسته تخم می شود (شکل2-3).
ویتلوژنین یک فسفولیپوگلیکوپروتئین مخصوص جنس ماده است که توسط کبد ماهی ماده در پاسخ به استروژنهای داخلی در چرخش، در مرحله زرده سازی سنتز میشود .این ماده ترکیب اصلی تشکیل دهنده زرده تخم است که پس از تولید در کبد، توسط جریان خون به تخمدان منتفل میشود و در آنجا نهایتا به عنوان ماده مغذی لازم برای رشد جنین، جذب اووسیتها میگردد [39].

شکل 2-3) مسیرهای اصلی عملکرد ترکیبات شبهاستروژنی موجود در محیط [26]:
هورمونهای استروئیدی از قبیل E2، تستوسترون و پروژسترون در سلولهای گنادی سنتز میشوند. بازدارندهی آنزیمهای CYP450 از جمله داروها و آفتکشها در این قسمت عمل میکنند.
هورمونها از گنادها به جریان خون ترشح میشوند و از طریق انتشار یا به صورت متصل به SHBG در دسترس سلولها قرار میگیرند. ترکیبات سمی میتوانند میزان در دسترسی هورمونها را با تغییر میزان SHBG تغییر دهند.
هورمون استروئیدی به درون سلول انتشار مییابد.
هورمون به داخل محوطهی پیشهستهای جایی که گیرندههای آزاد (R) وجود دارد، انتشار مییابد.
هورمون یا مقلد آن به گیرنده متصل میشود. تحقیقات نشان داده است که بسیاری از ترکیبات شیمیایی مصنوعی به گیرندههای استروژنی یا آندروژنی متصل میشوند.
گیرنده (R) اکنون به لیگاند طبیعی یا مصنوعی متصل میشود، متحمل تغییراتی در ساختار میگردد و در نهایت همودایمر تشکیل میدهد.
همودایمرها با تجمع فاکتورهای رونویسی (tf)[34]، یک گروه رونویسی تشکیل میدهند که به توالیهای خاصی در DNA ژنهای وابسته به هورمون که به عنوان عناصر پاسخ به هورمون (HRE)[35] شناخته میشوند، متصل میشوند.
mRNA به خارج از هسته و به درون سیتوپلاسم انتقال مییابد.
پروتئینها به کمک اسیدهای آمینه (aa) متصل به tRNA خاص (فلشهای پررنگ) و ریبوزومها و از روی mRNA الگو، سنتز میشوند.
پروتئین که محصول اصلی سیستم درونریز است میتواند به شکل آنزیم، هورمون پروتئینی یا فاکتور رشد و یا جزء ساختاری سلول باشد. مثالی از یک شاخص وابسته به هورمون، ویتلوژنین است.
در برخی موارد اثر ترکیبات سمی مخرب سیستم درونریز از طریق تغییر عملکرد کبد اعمال میشود.
بهطور طبیعی، ویتلوژنین تنها در پلاسمای ماهی ماده وجود دارد اما ماهیان نر نیز دارای ژن کدکننده این ترکیب هستند. بنابراین وقتی در معرض استروژنهای خارجی قرار میگیرند، این ژن به راحتی القاء میشود. از جمله مناسبترین روشهای آزمایشگاهی برای سنجش حضور و اثرات استروژنها در محیط، سنجش تولید ویتلوژنین توسط هپاتوسیتهای کبد ماهی است. از روشهای اندازهگیری این ترکیب، آنالیز نمونههای پلاسما با آزمونهای ایمنولوژیک از قبیل الایزا[36] و یا وسترن بلات با آنتیبادیهای خاص است. از آنجاییکه ویتلوژنین یک پروتئین گلیکولیپیدی بزرگ و در برخی گونهها شکننده و ناپایدتر است، احتمال دارد در زمان استفاده از آزمونهای ایمنولوژیک تخریب شود و مشکلاتی را به وجود آورد. بنابراین اندازهگیری بیان ژن کدکننده آن با استفاده ازReal-time PCR به دلیل دقت بسیار بالا، اخیرا بیشتر مورد توجه قرار گرفته است [101]. به دلیل سرعت بالای القاء VTG mRNA، این روش میتواند در پایش کوتاهمدت اکوسیستم بهکاررود.

شکل2-4). مکانیسم اثر هورمون استرادیول در تولید VTG و Zrp در ماهیان. در پاسخ به محرکهای نوری (hv)، GTH-। از هیپوفیز ترشح و توسط جریان خون به تخمدان منتقل میشود. در این بافت E2 سنتز و توسط جریان خون به کبد میرود و سبب تولیدVTG و Zrp در این بافت میگردد. این دو ترکیب نهایتا در اووسیتهای در حال تشکیل، تجمع مییابند [39].
ب- مطالعات فیزیولوژیک و رفتاری
از دیگر شاخصهای زیستی مورد استفاده در تعیین اثرات EDCها، مطالعات فیزیولوژیک و رفتاری ماهیان است. مطالعهی همزمان میزان ویتلوژنین و بافتشناسی گناد، درک گستردهای از سمشناسی تولیدمثلی[37] به همراه دارد [49]. در ماهیان نر، اثر مستقیم سنتز ویتلوژنین در شامل ایجاد جنسیت بینابینی در گناد، کاهش کلسیم در فلس و اسکلت، هایپرتروفی کبد، آسیب به کلیه، هدررفت شدید انرژی، تاخیر در ایجاد بیضه یا ایجاد بیضه غیرطبیعی و در نتیجه کاهش شایستگی تولیدمثلی است [39]. به علاوه تولید این ترکیبات در جنس نر سبب اختلال در دینامیک و عملکرد طبیعی خون میگردد [89]. از سوی دیگر ممکن است ویژگیهای ثانویه جنسی و علائم بدنی نیز به درستی تکامل نیابند و این مساله منجر به عدم بروز رفتارهای جنسی یا بروز رفتارهای غیرطبیعی گردد. در لارو ماهیان نر، حضور هورمونهای استروژنی در طی دوره حساسی از توسعه گنادی می تواند سبب مادهسازی کامل فنوتیپ شود. این موضوع سبب ایجاد مادههای ظاهراً طبیعی میگردد در حالی که این ماهیان از نظر ژنتیکی نر هستند. در ماهیان ماده، اثرات استروژنهای خارجی از اهمیت کمتری برخوردار است و میتواند سبب رسیدگی و توسعه زود هنگام و خارج از فصل تخمدان شود. سنتز خارج از برنامه Zrp در ماهیان ماده سبب ایجاد پوسته غیر طبیعی در تخمک، کاهش کیفیت تخم و در نتیجه کاهش بقا میگردد [39].
ج- شاخصهای وضعیت
شاخصهای اورگانوسوماتیک (نسبت وزن اندام/ وزن بدن) به ویژه GSI اطلاعات دقیقی از اندام موردنظر فراهم میکند. آلایندهها میتوانند تغییرات سریع و شدیدی را در این شاخصها بهوجود آورند. این تغییرات بسته به فصل و چرخه زندگی متفاوت هستند [56، 57].
2-2- مرور منابع
2-2-1- فراسنجههای خونی
ویژگیهای خونشناسی ماهیان یکی از مهمترین عوامل منعکسکننده ارتباط خصوصیات اکوسیستم آبی و سلامت آنها است. فراسنجههای خونی در ماهیان تحت تأثیر عوامل فیزیولوژیک مانند جنسیت، مرحله تولیدمثل، سن، اندازه و وضعیت سلامت آنها تغییر میکند و بنابراین شاخص مناسبی از وضعیت سلامت گونههای مختلف محسوب میشود. این فراسنجهها تحت تأثیر عوامل خارجی نظیر فصل، دمای آب، غذا، تنشهای محیطی، انواع آلودگی و انواع بیماریها نیز دچار تغییر میشوند [105]. مطالعات اندکی در رابطه با اثرات EDCها بر فاکتورهای خونشناسی ماهیان انجام گرفته و بیشتر اطلاعات در رابطه با سایر مهرهداران است.
مطالعه کلارک[38] (1984) بر روی پستانداران نشان داد که تعادل بین هورمونهای جنسی نر و ماده بر میزان حساسیت سیستم ایمنی موثر است. بهطور کلی هورمون جنسی نر (تستوسترون) محرک سیستم ایمنی و E2 و ترکیبات مصنوعی استروژنی غیر استرادیولی از قبیل دیاتیلاستیلبسترول بازدارندههای قوی سیستم ایمنی هستند. در طول بارداری تغییرات قابل توجهی در اندامهای لنفاوی مشاهده میشود، سطح E2 در سرم افزایش مییابد، تعداد لنفوسیتها به طور غیرطبیعی کم و ایمنی سلولی متوقف میشود [22].
مطالعه انجام شده توسط گلوب[39] و همکاران (2004) در مورد تاثیر دیاتیلاستیلبسترول و متوکسیکلر بر فاکتورهای خونی میمون رزوس (Macaca mulatta) نشان داد که تیمار میمونها با 5/0 میلیگرم دیاتیلاستیلبسترول/ کیلوگرم/ روز سبب کاهش معنیدار گلبولهای سفید به ویژه لنفوسیتها، هموگلوبین و هماتوکریت نسبت به گروه شاهد میشود. درحالیکه تیمار آنها با 50 میلیگرم متوکسیکلر/ کیلوگرم/ روز تاثیری بر فراسنجههای مذکور نداشت [40].
ون دن استین[40] و همکاران (2010) مشاهده کردند که در معرض گذاری سار اروپایی (Sturnus vulgaris) با گروهی از اترهای بیفنیلی پلی برومینه (PBDE)[41] به مدت 6 ماه به میزان 140 میکروگرم/کیلوگرم وزن بدن اثر معنیداری بر فراسنجههای خونی این پرنده از قبیل میزان گلبولهای قرمز، غلظت هموگلوبین و هماتوکریت ندارد [105].
آریکن و پلامپ[42] (1990) نشان دادند که در معرض قرارگیری گربهکاهی کانالی (Ictalurus punctatus) با حشرهکش اورگانوفسفاته مالاتیون[43] منجر به افزایش اریتروسیتها، هموگلوبین و میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH) [44] و کاهش لوکوسیتها میشود [11].
آدیمو[45] (2007) اثرات سرب (یکی از فلزات مخرب سیستم درونریز) را بر فاکتورهای خونشناسی نوعی گربهماهی با نام علمی Clarias gariepinus بررسی کرد. در این مطالعه، کاهش اریتروسیتها و میزان هموگلوبین و در نتیجه کمخونی وکاهش لوکوسیتها و بنابراین تضعیف سیستم ایمنی مشاهده شد. در این مطالعه هر سه شاخص حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)[46]، میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC)[47] و MCH در گروه تیمار نسبت به گروه شاهد افزایش یافت [7].
در مطالعهای که توسط برنتسن[48] و همکاران (2010) بر روی پست اسمولت آزادماهی اطلس (Salmo salar) تغذیه شده با اندوسولفان[49] انجام شد، هیچگونه تغییری در ویژگیهای خونشناسی از قبیل میزان اریتروسیت و هموگلوبین مشاهده نشد [16].
همانطور که در مثالهای مذکور مشاهده میشود، اثرات ترکیبات مخرب سیستم درونریز بر فراسنجههای خونی بسیار متفاوت و حتی گاهی متناقض است و به عواملی همچون گونه مورد بررسی، نوع ماده شیمیایی یا ترکیب و مقدار آنها بستگی دارد.
2-2-2- بافتشناسی گناد، GSI و نسبت جنسی
اولین شواهد مبنی بر توسعهی غیرطبیعی گناد در ماهی مقارن با کشف القاء ویتلوژنین در آنها بود. بیشتر اطلاعات در این مورد، مطالعاتی است که بر روی ماهیان در معرض پساب کارخانههای تصفیهی فاضلاب در انگلستان، انجام گرفته است. این ماهیان مسلما تحت تاثیر آلایندههایی با فعالیت استرونی قرار گرفتهاند [26].
هریس[50] و همکاران (1997) به شواهدی مبنی بر ممانعت از رشد بیضهها در ماهیان بالغ قزلآلایرنگینکمان (Oncorhynchus mykiss) در رودخانهای در انگلستان که شدیدا توسط ترکیبات استروژنی بهویژه آلکیلفنولها[51] آلوده است، دست یافتند [42].
گیمنو[52] و همکاران (1997) زمانیکه یک جمعیت نر از کپورمعمولی (Cyprinus carpio) را در دروهی جنینی-لاروی به مدت سه روز در معرض پنتیلفنول قرار دادند، هیچ اثری بر تمایز جنسی یا تکثیر سلولهای پیشساز جنسی[53] مشاهده نشد اما زمانی که این در معرضگذاری طولانیتر و از قبل از تمایز جنسی (24-51 روز پس از تفریخ) صورت گرفت، موجب تشکیل مجرای تخمبر و کاهش تعداد سلولهای پیشساز جنسی گردید [36].
هونتلا و همکاران (1992؛ 1995) از کشور کانادا نشان دادند که در هر دو جنس سوفماهی زرد (Perca flavescens) و اردکماهی شمالی (Esox lucius) در مناطق آلوده شده با PAHها، PCBها و فلزات سنگین، اندازهی گنادها و سطوح تیروکسین کاهش یافته بود.
در مطالعهای که مینیر[54] و همکاران (2000) بر روی Platichthys flesus ساکن مصبها و خلیجهای مناطق بسیار صنعتی انجام دادند، تغییر در الگوی اسپرماتوژنزیز و مشاهده جنسیت بینابینی در حدود 18% از ماهیان گزارش شد [70].
گزارش بتی و لیم[55] از کشور اتریش نشان داد که گنوپودیوم پشهماهی نر (Gambusia affinis) که در پاییندست کارخانهی تصفیهی پساب زندگی میکند از نظر اندازه تحلیل رفته است [15].
در مطالعهای که توسط جفریز[56] و همکاران (2008) بر روی جمعیتی از نوعی گونه مینو بومی آمریکای شمالی با نام علمی Rhinichthys cataractea در یکی از رودخانههای کانادا صورت گرفت، تغییر شدید نسبت جنسی به نفع جنس ماده، به اختلال شدید سیستم درونریز به دلیل حضور ترکیبی از آلایندههای شبهاستروژنی موجود در پسابهای شهری، کشاورزی و دامپروری در این منطقه نسبت داده شد [54].
2-2-3- تولید ویتلوژنین و ارزیابی بیان نسبی آن
بیشتر مطالعات انجام شده در این رابطه در محیطهای آزمایشگاهی و از طریق اندازهگیری میزان پروتئین ویتلوژنین در پلاسما با استفاده از دو روش الایزا و وسترن بلات انجام گرفته است و اطلاعات در زمینه القاء ژن کدکننده آن در نتیجه حضور ماهی در اکوسیستمهای آلوده به انواع مختلف EDCها محدود است.
لیندهولست[57] و همکاران (2000) مشاهده کردند که که حضور قزلآلایرنگینکمان در معرض 500 میکروگرم بیسفنولآ/ میکرولیتر، پس از 14 روز موجب افزایش میزان ویتلوژنین در پلاسما شد درحالیکه در غلظتهای کمتر، سطح آن در پلاسما ثابت بود [66].
در آزمایشی که توسط آنکلی[58] و همکاران (2001) بر ماهیان بالغ مینو کلهگنده (Pimephales promelas) انجام شد، تیمار این ماهیان با متوکسی کلر به مدت حداکثر 21 روز، غلظت برخی از استروئیدهای جنسی (تستوسترون، 11-کتوتستوسترون و E2) را در هردوجنس کاهش داد و منجر به القاء شدید ویتلوژنین در پلاسمای خون ماهیان نر شد [10].
همر[59] و همکاران (2001) پس از 5 روز تیمارجنس نر ماهی Cyprinodin variegates با نانیلفنول، متوکسیکلر و اندوسولفان، توانستند بیان ژن ویتلوژنین (VTG mRNA) و همچنین پروتئین ویتلوژنین در پلاسما را اندازهگیری کنند [45].
تیان[60] و همکاران (2009) دریافتند که تیمار جنس نر گلدفیش (Carassius auratus) با غلظتهای مخلتف مونوکروتوفوس[61]، منجر به افزایش وابسته به دوز میزان بیان ژن ویتلوژنین در کبد و پروتئین آن در پلاسما میشود [102].
در مطالعهای که توسط جفریز و همکاران (2008) بر روی جمعیتهای طبیعی ماهی R. cataractea در دو رودخانه اولدمن[62] و بو[63] در استان آلبرتا کانادا صورت گرفت، بیشترین میزان بیان ژن ویتلوژنین و تغییر نسبت جنسی به نفع جنس ماده در مناطق آلوده شده با پساب زمینهای کشاورزی متراکم در رودخانه اولدمن مشاهده شد [54].
در مطالعه دیگری که جفریز و همکاران (2010) بر روی جمعیتهای طبیعی ماهی R. cataractea در دو رودخانه رددیر[64] و اولدمن همان استان انجام دادند، دریافتند در این رودخانهها که توسط انواع مختلف EDCها از قبیل استروژنهای مصنوعی موجود در قرصهای ضدبارداری و انواع طبیعی آن از قبیل هورمونهای موجود در پساب کارخانههای تصفیه فاضلاب آلوده شده است، میزان پروتئین ویتلوژنین در پلاسمای ماهیان نر با GSI آنها همبستگی معکوس دارد [55].
در مطالعه دیگری که توسط انگامنیوم[65] و پانیاراچون[66] (2011) در تایلند بر روی جمعیت وحشی گونه Oryzias minutillus رودخانههای آلوده با آلایندههای صنعتی از جمله بیسفنولآ انجام گرفت، در کبد ماهیان نری که در آنها جنسیت بینابینی رخ داده بود، بیان mRNA ویتلوژنین مشاهده شد. در حالیکه در ماهیان دارای گناد طبیعی، این ژن بیان نشده بود [74].

-196215-168402000فصل سوم
مواد و روشها
3-1- معرفی گونه مورد مطالعه
عروسماهی زایندهرود P. esfahani از خانواده کپورماهیان از جمله ماهیان با ارزش در صید ورزشی در حوضه زایندهرود، است (شکل 3-1). این گونه علاوه بر جثه کوچک، از فراوانی مناسبی در سراسر رودخانه زایندهرود برخوردار است و لذا امکان صید آن به سهولت فراهم است. این ویژگی به همراه پراکنش در برخی از مهمترین منابع آلوده کننده اکوسیستم زایندهرود، آن را به گونه ای مناسب برای این مطالعه تبدیل کرده است. تخمریزی این ماهی در چشمه دیمه واقع در بالادست سد زایندهرود از ماه اردیبهشت تا تیر ماه ادامه و در مرداد ماه خاتمه مییابد. رسیدگی تخمکها در تخمدان به طور همزمان و از نوع همزمان گروهی است]2[.

شکل 3-1) عروسماهی زایندهرود صید شده از رودخانه زاینده رود [نگارنده].
3-2- ایستگاههای نمونهبرداری
در این مطالعه تعداد چهار ایستگاه نمونهبرداری درطول رودخانه تعیین گردید. دو ایستگاه در بالادست رودخانه زایندهرود به عنوان ایستگاههای شاهد و دو ایستگاه بر اساس نحوه کاربری اراضی حاشیه رودخانه، به عنوان ایستگاههای آلوده پیشبینی شد (شکل 3-2). این ایستگاهها از بالادست به پاییندست شامل:1) چشمهدیمه قبل از سد زایندهرود و 2) خرسونک بهعنوان ایستگاههای پاکیزه 3) چمگردان به دلیل سکون آب، ورود فاضلاب ذوب آهن و پساب زمینهای کشاورزی مجاور (شکل3-3) و 4) پل صفائیه به دلیل ورود پساب کارخانه تصفیه فاضلاب زرینشهر و زمینهای کشاورزی مجاور به عنوان ایستگاههای آلوده انتخاب شد. اطلاعات و ویژگیهای مربوط به ایستگاههای نمونهبرداری شده درجدول 3-1 آورده شده است. صید ماهیان از این ایستگاهها در زمستان سال 1390 و بسته به موقعیت محل با استفاده از تور پره یا الکتروشوکر انجام گردید.

شکل 3-2) موقیعت جغرافیای ایستگاههای نمونه برداری.
جدول3-1) محل و موقعیت جغرافیایی صید عروسماهی زایندهرود P. esfahani
نام ایستگاه مختصات جغرافیایی
چشمهدیمه ˝00 ’31˚32 شمالی˝42 ’13˚50 شرقیخرسونک ˝00 ’31˚32 شمالی ˝00 ’22˚50 شرقی
چمگردان ˝09 ’23˚32 شمالی ˝39 ’17˚51 شرقی
پل صفائیه ˝45 ’21˚32 شمالی ˝55 ’26˚51 شرقی

شکل 3-3) ایستگاه چمگردان. الف- کارخانه ذوبآهن ب- زمینهای کشاورزی در حاشیه ایستگاه [نگارنده].
ماهیان صید شده از هر از ایستگاه به طور جداگانه و به صورت زنده در کیسه های حاوی آب مربوط به آن ایستگاه واکسیژن به آزمایشگاه دانشکده منابع طبیعی واقع در دانشگاه صنعتی اصفهان منتقل شدند.
3-3- زیستسنجیبرای انجام زیستسنجی، ماهیان در محلول MS222 با غلظت 100 ppm بیهوش و موارد زیر در آنها اندازه گیری شد:
وزن بدن و گناد با استفاده از ترازو و با دقت 01/0 گرم
پارامترهای طولی (طول کل، چنگالی و استاندارد) با دقت 1 میلیمتر
3-4- فراسنجههای خونی
بلافاصله پس از صید اقدام به بیهوشی ماهیان و خونگیری از طریق ساقه دمی و با استفاده از سرنگ آغشته به EDTA 5/0% شد (شکل 3-4). نمونههای خونی درکوتاهترین زمان و در دمای کمتر از چهار درجه سانتیگراد جهت بررسیهای زیر به آزمایشگاه شیلات دانشکده منابع طبیعی منتقل شد.
3-4-1- اندازهگیری هموگلوبین
برای اندازهگیری هموگلوبین (Hb) از روش سیانوهموگلوبین استفاده شد. در این روش به میزان 20 میکرولیتر نمونه خون مقدار 5 میلیلیتر محلول درابکین[67] افزوده میشود. این محلول حاوی سیانید پتاسیم است. طی واکنشی، سیانید پتاسیم مت هموگلوبین را به سیان مت هموگلوبین تبدیل میکند. این ماده دارای جذب حداکثر در 540 نانومتر است. مقدار جذب نوری توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازهگیری و در نهایت با منحنی استاندارد تعیین هموگلوبین مقایسه میگردد [4].

شکل3-4) خونگیری از ساقه دمی عروسماهی زایندهرود [نگارنده].
3-4-2- اندازهگیری هماتوکریت
هماتوکریت (HCT) روشی برای اندازهگیری حجم تودهای یا ذرهای یاختههای قرمز نسبت به حجم کل خون است که بر حسب حجم گلبول قرمز در 100 میلیلیتر خون بیان میشود. برای اندازهگیری هماتوکریت، لولههای موئینه میکروهماتوکریت را به ماده ضد انعقاد آغشته و با نمونه خون تماس داده شد تا لوله از خون پر شود. پس از اینکه سه چهارم لوله از خون پر شد، سر لوله با انگشت و سپس با خمیر مخصوص مسدود شد. سپس این لوله به داخل سانتریفیوژ میکروهماتوکریت منتقل و به مدت 5 دقیقه با سرعت حداقل 7000 دور بر ثانیه سانتریفیوژ و درصد هماتوکریت با استفاده از خطکش مخصوص قرائت شد [4، 48].
3-4-3- شمارش گلبولهای قرمز
در پزشکی جهت شمارش گلبولهای قرمز خون (RBC)[68] از دستگاههای خودکار شمارنده سلول استفاده میشود. اما در ماهیان به دلیل اندازه بزرگ و هستهدار بودن اریتروسیتها امکان استفاده از این دستگاهها وجود ندارد. بنابراین به این منظور از لام هموسیتومتر نئوبار استفاده میشود. اما چون تراکم سلولهای خونی بالاست و امکان روی هم افتادگی این سلولها وجود دارد و نیز جهت تفکیک سلولهای مختلف از یکدیگر، عمل رقیق سازی خون انجام میشود. برای رقیق سازی یاختههای قرمز خون از پیپت ملانژور قرمز استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم لوله تا درجه 101 از محلول رقیق کننده پر میشود (رقت یک دویستم). در این مطالعه از محلول رقیق کننده Dace استفاده شد. محلول Dace از ترکیب 1/0 گرم ترکیب بریلیانت کریزل بلو[69]، 8/3 گرم سدیم سیترات و 2/0 میلیلیتر فرمالدهید 37% در 100 میلیلیتر آب مقطر ایجاد می شود [30]. پس از قرار دادن لامل روی لام هموسیتومتر، سه تا چهار قطره از مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یافته و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای قرمز موجود در 5 مربع کوچک از 25 مربع مرکزی با لنز 40 شمارش شد (شکل 3-5). برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:
(3-2)
(3-3)
در این رابطه N مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای قرمز شمارش شده در 5 مربع کوچک، S مساحت 5 مربع (یک پنچم مترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک دویستم) را نشان میدهد [4].
3-4-4- شمارش گلبولهای سفید
به دلیل تراکم کمتر سلولهای سفید خون (WBC)[70] نسبت به یاختههای قرمز، رقیق سازی با رقت کمتری صورت میگیرد. به این منظور از پیپت ملانژور سفید استفاده میشود. برای استفاده از این نوع پیپت، تا درجه 5/0 آن از خون و بقیه حجم لوله تا درجه 11 از محلول رقیق کننده ریس پر میشود (رقت یک بیستم). سپس همانند روش توضیح داده شده، سه تا چهار قطره مایع درون پیپت را تخلیه شد تا در فاصله بین آن دو جریان یابد و حجره لام را پرکند. لام در زیر میکروسکوپ قرار گرفت و یاختههای سفید موجود در چهار مربع کوچک که در چهار گوشه مربع بزرگ قرار دارند با لنز 20 شمارش شد (شکل3-3). برای محاسبه تعداد گلبولهای قرمز در هر میلیمتر مکعب خون با رقت یک دویستم از رابطه ذیل استفاده شد:
(3-4)
(3-5)
در این رابطه N مجموع یاختههای سفید شمارش شده در یک میلیمتر مکعب، n مجموع تعداد یاختههای سفید شمارش شده در چهار4 مربع، S مساحت چهار مربع (چهار میلیمترمربع)، h ارتفاع هر مربع (1/0 میلیمتر) و d رقت خون در محلول رقیق کننده (یک بیستم) را نشان میدهد [4].

شکل 3-5) لام هماسیتومتر [4].
3-4-5- شمارش افتراقی گلبولهای سفید
تهیه گسترش خونی به روش دولامی انجام گرفت. در این روش یک لام به عنوان گسترش دهنده و لام دیگر که قطره خون روی آن قرار میگیرد، لام گسترش نام دارد. پس از ایجاد گسترش خونی، جهت جلوگیری از تغییرشکل یاختهها، تاثیر میکرواورگانیسمها و کاهش کیفیت، لام گسترش بلافاصله با متانول 95% تثبیت و سپس خشک میگردد. سپس به مدت 10-30 دقیقه با محلول گیمسا رنگآمیزی و با آب شستشو و خشک میشود. این محلول با داشتن اجزاء اسیدی و بازی، قسمتهای مختلف هر نوع سلول را به رنگ مشخصی رنگامیزی میکند و به این صورت سلولها قابل تشخیص و شمارش میگردند. برای تهیه محلول گیمسا ابتدا 1 گرم پودر گیمسا با 50 میلیلیتر گلیسرول همراه با یک هم زن مغناطیسی به مدت 1 ساعت در 60 درجه سانتی گراد حرارت داده شد. بعد از سرد شدن این ترکیب، 50 میلیلیتر متانول به آن اضافه و با کاغذ صافی فیلتر شد. این استوک با استفاده از آب شهری تا 10% رقیق شد و برای رنگ آمیزی گسترشها مورد استفاده قرار گرفت. درهرگسترش تعداد 100 عددگلبول سفید به صورت تصادفی شمارش و درصد فراوانی آنها محاسبه شد [19].
3-4-6- شاخصهای ثانویه خونشناسی
شاخصهای ثانویه خونشناسی برای توصیف اندازه سلولها و میزان هموگلوبین آنها بهکار میرود [4].
الف- حجم متوسط گویچه قرمز (MCV)
این شاخص حجم متوسط هر یاخته قرمز خون را نشان میدهد. این شاخص بر حسب فمتولیتر محاسبه میشود. هر فمتولیتر برابر یک میکرومتر مکعب است.
(3-6)
در این رابطه، HCT میزان هماتوکریت و RBC تعداد یاختههای قرمز خون (بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4].
ب- میانگین غلظت هموگلوبین ذرهای (MCHC)
این شاخص غلظت هموگلوبین در توده یاختههای قرمز را بر حسب درصد نشان میدهد.
(3-7)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و HCT میزان هماتوکریت را نشان میدهد [4].
ج- میانگین هموگلوبین ذرهای (MCH)این شاخص متوسط هموگلوبین در یک یاخته قرمزخون را بر حسب پیکوگرم نشان میدهد.
(8-3)
در این رابطه، Hb میزان هموگلوبین (بر حسب گرم در دسیلیتر) و RBC(بر حسب میلیون در میلیمتر مکعب) را نشان میدهد [4].
3-5- تعیین سن
برای تعیین سن از روش‌ آناتومیکی (فلس) استفاده شد. اساس کار در این روش تغییرات دوره‌ای است که در رشد سالانه ماهی روی می‌دهد.در این بررسی سن ماهیان با استفاده از بررسی دوایر سنی موجود روی فلس های برداشت شده از ناحیه بین خط جانبی و جلو باله پشتی انجام شد. رشد فلس متناسب با رشد ماهی است. همزمان با رشد فلس، حلقههای رشد سالیانه در حاشیه فلس تشکیل می شود. حلقه های رشد، یک الگوی متحدالمرکز است که مرتبط با شرایط محیطی و رشد در طی یک سال تشکیل می شود. به کمک این حلقه ها می توان سن ماهی را تعیین کرد [88]. برای زایل نمودن مواد لزج موکوسی روی فلس، شستشوی آن با آب گرم و محلول های تمیز کننده مانند مایع ظرفشویی و سپس آب مقطر انجام شد. فلس‌های آماده شده به کمک میکروسکوپ مطالعه گردید.
3-6- محاسبه شاخص توسعه گنادی (GSI)
پس از تعیین جنسیت، گنادها به طور کامل خارج و برای محاسبه GSI با دقت 01/0 گرم وزن گردید. این شاخص به صورت زیر محاسبه می گردد [17]:
(3-9)در این رابطه برابر با وزن گناد و برابر با وزن بدن ماهی است.
3-7- تهیه بافت گناد
در این مطالعه، بخش میانی گناد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه بهطور تصادفی انتخاب و به منظور انجام مطالعات بافت شناسی در فرمالین 10% قرار داده شد. سپس نمونه ها از مراحل آبگیری از طریق الکل با درجات مختلف، شفاف سازی با استفاده از گزیلول، پارافینه کردن، قالب‌گیری، برش و رنگ‌آمیزی به روش استاندارد هماتوکسیلین-ائوزین عبورداده شد. پس از رنگآمیزی با استفاده از میکروسکوپ نوری مرحله توسعه گنادی در جنس نر و ماده مورد شناسایی قرار گرفت [71].3-8- آمادهسازی نمونهها جهت مطالعات مولکولی و اندازهگیری بیان ژن ویتلوژنین
بررسی های مولکولی شامل توالییابی ژن کدکننده ویتلوژنین و بررسی بیان آن، در طی دوره فرصت مطالعاتی تحت نظر پروفسور گنزالو مارتینز-ردریگز[71] در مرکز علوم دریایی اندلوسیا[72]، کادیز[73]، اسپانیا اجرا گردید. در تمام پروتوکلها شامل کیتهای تجاری مورد استفاده، دستورالعمل شرکت سازنده دنبال شد. تمام آغازگرها از شرکت اینتگریتد DNA تکنولوژیز[74] (کشور بلژیک) خریداری شد. توالییابیها با روش Dideoxy و توسط شرکت بیوتکنولوژی کمپانی (بیواری)[75] انجام گردید.
3-8-1- نمونهبرداری و تیمار
در این مطالعه حدود 30 میلیگرم از کبد تعداد 5 قطعه ماهی ماده و 5 قطعه ماهی نر از هر ایستگاه به منظور انجام مطالعات مولکولی در تیوبهای 5 میلیلیتری حاوی محلول محافظتکننده از RNA[76] (ساخت شرکت فیت بیوتکنولوژی[77]) قرار داده شد و برای استخراج RNA کل در دمای C°20- قرار گرفت.
از آنجاییکه برای اندازهگیری میزان بیان هر ژن داشتن آغازگرهای اختصاصی در همان گونه الزامی است و توالی ژن ویتلوژنین و بتااکتین عروسماهی زایندهرود تاکنون در بانک جهانی ژن به ثبت نرسیده است، لازم بود توالییابی و همسانهسازی[78] این دو ژن برای اولین بار در این گونه صورت پذیرد. از سوی دیگر با وجود ثبات نسبی ژن ویتلوژنین در بین ماهیان، به دلیل وجود ایزوفرمهای متعدد این ژن، به منظور جلوگیری از خطا در زمان اندازهگیری بیان ژن و ایجاد محصولات جانبی در واکنشهای زنجیرهای پلیمراز (PCR)[79]، توالییابی کامل این دو ژن انجام گردید و سپس آغازگرهای مناسب برای انجام Real-time PCR از روی آن طراحی شد.
با توجه به اینکه نمونهبرداری در زمان مورد انتظار برای بالا بودن بیان ژن ویتلوژنین صورت نگرفته بود، گروهی از ماهیان پس از صید به مدت 24 ساعت تحت تیمار 2000 نانوگرم 17بتا-استرادیول/ لیتر قرار گرفتند تا بیان این ژن به میزان کافی برای ساخت cDNA اختصاصی افزایش یابد [29]. کبد آنها به تفکیک جنسیت در تیوبهای حاوی محلول محافظتکننده از RNA و تا زمان استخراج RNA در دمای C°20- قرار گرفت.
3-8-2- استخراج و تعیین کمیت و کیفیت RNA
در تمام نمونهها، RNA با استفاده از کیت نوکلئواسپین RNA II[80] ساخت شرکت مچری-ناجل[81] استخراج شد و هضم DNA بر روی ستون و با استفاده از آنزیم DNase فاقدRNase موجود در کیت انجام گرفت. کمیت RNA به روش اسپکتروفتومتری در طول موج 250 نانومتر توسط دستگاه بیوفتومترپلاس[82] ساخت شرکت اپندورف[83] مورد بررسی قرار گرفت. به علاوه کیفیت تقریبی آن از طریق دو شاخص که از رابطه میزان جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر و همچنین 260 نانومتر/ 230 نانومتر بهدست میآید و مستقیما توسط دستگاه محاسبه میشود، مورد ارزیابی قرار گرفت. حداکثر جذب نوری توسط RNA در 260 نانومتر صورت میگیرد. درحالیکه پروتئین دارای حداکثر جذب نوری در 280 نانومتر است. بنابراین نسبت جذب نوری در 260 نانومتر/ 280 نانومتر شاخص مناسبی برای ارزیابی آلودگیهای پروتئینی است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-8/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میگردد. برای بررسی بیشتر کیفیت RNA از نسبت جذب نوری 260 نانومتر/ 230 نانومتر استفاده میشود. اما بر خلاف شاخص نسبت میزان جذب نوری در 260 نانومتر/280 نانومتر که بیشتر تحت تاثیر آلایندههای پروتئینی و نوکلئوتیدی تغییر میکند، این شاخص تحت تاثیر تعداد بیشتری از آلایندهها قرار دارد و در نتیجه از دقت کمتری برخوردار است. چنانچه مقدار این شاخص در دامنه 2-7/1 قرارگیرد، کیفیت RNA مناسب ارزیابی میشود [76].
برای بررسی دقیقتر کیفیت RNA از دستگاه بیوآنالیزور 2100[84] و کیت RNA نانو 6000[85] ساخت شرکت اجیلنت تکنولوژیز، لایف ساینسیز[86] استفاده شد. این دستگاه با استفاده از شاخصی به نام RIN [87] کیفیت RNA را نمایش میدهد. این شاخص به منظور استانداردسازی فرایند تفسیر صحت RNA و حذف تفسیرهای شخصی از کیفیت RNA ابداع شده است که روش ازریابی به روش الکتروفورز نیز در آن مدنظر قرار میگیرد. این روش چون بر مبنای تعیین چشمی نسبت ریبوزومی (که از تقسیم زیرواحدهای 18S به 28S به دست میآید) از روی ژل حاصل از الکتروفورز ایجاد میشود، معمولاً با خطا همراه است. در صورتیکه نرمافزار الگوریتمی RIN، علاوه بر اینکه این شاخص را به صورت خودکار تعیین میکند، یک سیستم نمرهدهی از 1 تا 10 ارائه میدهد که در آن 10 دارای بهترین و 1 دارای بدترین کیفیت RNA است (شکل 3-6) [73].
3-8-3- سنتز cDNA
برای سنتز cDNA جهت توالییابی، RNA کل استخراج شده یک نمونه ماهی نر تیمار شده با 17آلفا-استرادیول و همچنین یک نمونه ماهی ماده از ایستگاه چشمهدیمه انتخاب شد. دلیل انتخاب جنس نر، حساسیت بالاتر این جنس به حضور استروژنهای محیطی و در نتیجه افزایش بیان ویتلوژنین در نتیجه تیمار است.
حدود 500 نانوگرم از هریک از آنها با استفاده از کیت سنتز cDNA به نام کیواسکریپت[88] ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز[89] بهصورت معکوس رونویسی شد. بهطور خلاصه، واکنش با استفاده از کیو اسکریپت ریاکشن میکس[90] (1X از غلظت نهایی) و کیواسکریپت ریورس ترنسکریپتاز[91] (5/2X از غلظت نهایی) انجام گرفت. برنامه رونویسی معکوس شامل 5 دقیقه در C°22، 30 دقیقه در C°42 و 5 دقیقه در C°85 بود.
3-8-4- همسانهسازی cDNA نسبی ویتلوژنین در P. esfahani
آغازگرهای اختصاصی ژن ویتلوژنین از مناطق بسیار باثبات cDNA کامل سایر ماهیان استخوانی طراحی شد (جدول 3-2). PCR با استفاده از 1 واحد بیوتک DNA پلیمراز[92] (ساخت شرکت بیولاین[93])، cDNA، بافر PCR شرکت سازنده (1X از غلضت نهایی)، 5/0 میکرومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس، 2/0 میلی مولار dNTPs و 5/1 میلی مولار MgCl2 در حجم نهایی 20 میکرولیتر انجام شد. برنامه PCR شامل 10 دقیقه واسرشتهسازی اولیه در C°95، 35 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 30 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°4/60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°72 ) و 10 دقیقه بسط نهایی در C°72 توسط دستگاه مسترسایکلر پرواس[94] (ساخت شرکت اپندورف) بود.
محصول PCR در ژل آگارز 1% با TBE 1X رنگآمیزی شده با جل رد[95] (ساخت شرکت بیوتیوم[96]) اجرا و توسط سیستم کمیداک ایکس.آر.اس[97] و به کمک نرمافزار ایمیج لب[98] (ساخت شرکت بیورد[99]) قابل رویت شد. محصول PCR توسط کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ[100] ( ساخت شرکت مچری-ناجل) تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ[101] (ساخت شرکت اینویتروژن لایف تکنولوژیز[102]) به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شد. محصول این کیت برای انتقال به سلولهای Escherichia coli و سپس کشت در پلیتهای آگار LB آمپیسیلین به مدت یک شب در C°37 مورد استفاده قرار گرفت. پس از کشت 6 کلون باکتریایی در 3 میلیلیتر از محیط کشت مایع LB آمپیسیلین به مدت یک شب در شیکر C°37، با استفاده از کیت نوکلئواسپین پلاسمید[103] (ساخت شرکت مچری-ناجل) پلاسمید استخراج شد. در هر دو کلون، هر دو رشته توسط آغازگرهای مستقیم و معکوسM13 توالییابی شد.
3-8-5- همسانهسازی cDNA نسبی بتا-اکتین در P. esfahani
به منظور حصول توالی اولیه بتا-اکتین در عروسماهی زایندهرود، از آغازگرهای مورد استفاده برای همسانهسازی نسبی ژن بتا-اکتین در Rhamdia quelen (KC195970) استفاده شد (جدول 3-2) [13]. کلیه مراحل PCR، تصفیه، همسانهسازی و توالییابی مطابق با روش بند 3-8-4 انجام گردید.
3-8-6- بسط ویتلوژنین به سمت انتهای َ3از آنجایی که انتظار میرفت فاصله قطعه کوتاه میانی cDNA ویتلوژنین در P. esfahani تا انتهای َ3 آن بسیار طویل باشد، از استراتژی بسط این قطعه به سمت مناطقی از ژنوم که در بین بسیاری از کپورماهیان باثبات بود، استفاده شد. به این منظور، با استفاده از سه آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه ویتلوژنین میانی موجود طراحی شد و 3 آغازگر دژنره[104] معکوس از مناطق باثبات سایر کپورماهیان بهویژه گونههایی که در بلاست[105] قبلی قطعه ویتلوژنین میانی شباهت بیشتری را نشان داده بودند، چندین PCR انجام شد (جدول 3-2). تمام PCRها مطابق با برنامه بند 3-8-4 انجام گرفت. تنها زمان بسط به 2 دقیقه و 30 ثانیه افزایش یافت. پس از هر سه Nested PCR، قطعات در ژل آگارز 1% با TBE 1X اجرا شدند. باندهای دارای اندازه پیشبینی شده از داخل ژل بریده و با استفاده از کیت نوکلئواسپین جل اند PCR کلین-آپ تصفیه شدند. این قطعات با استفاده از کیت کلونینگ جت PCR[106] (ساخت شرکت فرمنتاس لایف ساینسیز[107]) به داخل وکتور pJET1.2/blunt کلون شدند.
3-8-7- تکثیر سریع دوانتهای cDNA (RACE)[108] در ویتلوژنین
به منظور همسانهسازی انتهای َ3 در ویتلوژنین، چندین مرحله PCR با 4 آغازگر Nested مستقیم که در انتهای َ3 قطعه طویل شده آن از مرحله قبل طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل 3’RACE کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس[109] (ساخت شرکت امبیون، لایف تکنولوژیز[110]) انجام شد. با استفاده از آداپتور 3’RACE موجود در کیت، رونویسی معکوس RNA کل صورت گرفت. شرایط PCR مشابه بند 3-8-4 بود.
برای کلون انتهای َ5 از پروتوکل 5’RACE کیت مذکور استفاده شد. در این پروتوکل بهطور خلاصه cDNA با استفاده از 1 میکروگرم RNA کل به همراه دسامرهای تصادفی موجود در کیت سنتز گردید. دو مرحله PCR با شرایط مشابه بند 3-8-4 و با استفاده از 2 آغازگر معکوس طراحی شده در انتهای َ5 قطعه cDNA میانی بهدست آمده از مراحل قبلی، انجام گرفت (جدول 3-2). در این واکنشها، آغازگرهای خارجی و داخلی َ5 موجود در کیت به عنوان آغازگر مستقیم استفاده شدند.
تمام محصولات حاصل از پروتوکلهای َ3 و َ5 در ژل آگارز 1% اجرا شدند. باندهای دارای اندازه مورد انتظار جدا و تصفیه و به منظور توالییابی با استفاده از کیت کلونینگ توپو-تی.آ به داخل وکتورpCR®4TOPO® کلون شدند.
در نهایت هر سه توالی cDNA بدست آمده (َ3، میانی و َ5) با توجه به 100% شباهت در قسمتهای دارای همپوشانی و با استفاده از یک ادغام کننده الگوریتمی (http://pro.genomics.purdue.edu/emboss/) به یکدیگر متصل شدند.
3-8-8- تکثیر سریع دوانتهای cDNA در بتا-اکتین
به منظور همسانهسازی انتهای َ3 و َ5 در بتا-اکتین، چندین مرحله PCR با 2 آغازگر Nested که در قطعه میانی آن طراحی شده بود، در مقابل آغازگرهای معکوس خارجی و داخلی پروتوکل َ3 و َ5 ریس کیت فرست چویش آر.ال.ام-ریس مطابق بند 3-8-7 انجام شد.
3-8-9- آنالیز توالیها
اطلاعات مربوط به توالیها با استفاده از نرمافزار Chromas Lite (v.2.1) (http://www.technelysium.com.au) رویت، توسط نرمافزارGeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) گردآوری و ادغام [75] و با استفاده از بلاست نوکلئوتید و پروتئین (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) آنالیز شد. برای ترجمه توالی از ORF به آمینواسید از ابزار ترجمه نرمافزار ExPaSy (http://web.expasy.org) استفاده شد.
3-8-10- ترسیم درخت فیلوژنی برای پروتئین ویتلوژنین در عروسماهی زایندهرود
پس از همترازی[111] توالی پروتئینی به دست آمده از عروسماهی زایندهرود و سایر توالیهای آمینواسیدی ماهیان و برخی دیگر از مهراداران تخمگذار توسط ClustalW، آنالیزهای فیلوژنیکی و تکاملی توسط نرمافزار MEGA5 انجام گرفت [100]. تاریخچه تکامل با استفاده از روش Neighbor-Joining استنباط شد [86]. تلفیق خودکار درخت، از 1000 تکرار به دست آمد. درصد تکرار درختهایی که در آنها گروه یکسانی از تاکسونها گرد هم آمدند، در کنار شاخهها نشان داده شد [33]. این درخت بر اساس مقیاسی ترسیم گردید که در آن طول شاخهها دارای واحد یکسان با فواصل تکاملی مورد استفاده در استنباط درخت فیلوژنی است. فواصل تکاملی با استفاده از روش اصلاحی Poisson محاسبه شد [112]. این فواصل بر اساس واحدهایی از تعداد آمینواسید های جایگزین در هر جایگاه است. در این آنالیز از 57 توالی آمینواسیدی استفاده شد. تمام جایگاههایی که فاقد اطلاعات یا دارای وقفه در اطلاعات بودند، حذف شدند. مجموعه نهایی دادهها دارای 606 جایگاه متغیر آمینواسیدی بود.
3-8-11- اندازهگیری بیان ژن از طریق PCR کمی (QPCR)[112] رونوشت معکوس
استخراج RNA کل و تعیین کیفیت و کمیت آن با استفاده از روش ارائه داده شده در بند 3-8-2 تعیین گردید. تنها نمونههایی از RNA که دارای RIN بالاتر از 7 بودند برای اندازهگیری کمی بیان ژن مورد استفاده قرار گرفتند. کمی سازی با استفاده از سایبر گرین[113] و در دستگاه مسترسایکلر اپگرادیانت اس ریل پلکس 2[114] و نرم افزار Realplex software (v.2.2) (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
در این مطالعه، به منظور نرمالسازی واریانس بین دادهها و امکان مقایسه آنها از ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی استفاده شد. با وجود اینکه واریانس بتا-اکتین تحت شرایط آزمایش ما 35/1 CT بود، نتایج بر اساس آن نرمال سازی شد.RNA کل به روشی که قبلا در بند 3-8-3 توضیح داده شد، بهصورت معکوس رونویسی شد. سپس cDNA با استفاده از محلول 10 میلی مولار Tris-HCl و 1/0 میلی مولار EDTANa2 با pH 8.0، 10 برابر رقیق شد. واکنشهایQPCR با 10 نانوگرم از cDNA، 200 نانومولار از هر یک از آغازگرهای مستقیم و معکوس (جدول 3-2) و پرفکتا سایبر گرین فست میکس[115] (ساخت شرکت کوانتا بیوساینسیز) انجام شد. واکنشها درون پلیتهای 10 میکرولیتری سمی-اسکرتد تواین تک Real-time PCR 96[116] (ساخت شرکت اپندورف) پوشیده شده با ادهسیو مسترکلیر Real-time PCR فیلم[117] (ساخت شرکت اپندورف) انجام گرفت.
برنامه PCR شامل 5 دقیقه مرحله واسرشتهسازی اولیه و فعالسازی پلیمراز در C°95، 40 سیکل تکثیر (واسرشتهسازی به مدت 15 ثانیه در C°95، الحاق به مدت 30 ثانیه در C°60 و بسط به مدت 30 ثانیه در C°60) و منحنی ذوب نهایی به مدت 20 دقیقه ازC °60 تاC °95 بود.
منحنی ذوب به منظور حصول اطمینان از تکثیر تنها یک محصول و عدم وجود محصولات جانبی حاصل از پرایمر دایمر استفاده شد. به علاوه، محصولات PCR در ژل آگارز 2% اجرا و سپس همسانهسازی و توالییابی شدند. توالیهای بهدست آمده با ژنهای موردنظر مطابقت داشتند.
بهمنظور بهینه سازی شرایط QPCR، ترکیب مختلف آغازگرها (3 جفت برای بتا-اکتین و 12 جفت برای ویتلوژنین)، دماهای مختلف الحاق (C°60-50) در آغازگرهای انتخاب شده و غلظتهای متفاوت از آغازگرها (100، 200 و 400 نانومولار) و cDNA الگو (5 سری رقیق سازی 10/1 از 10 نانوگرم تا 1 پیکوگرم) استفاده شد. در منحنیهای ذوب حاصل، راندمان تکثیر و r2 برای ویتلوژنین و بتا-اکتین اندازهگیری شد. کمی سازی نسبی ژن با استفاده از روش مقایسه CT (∆∆CT) و مطابق با فرمول ذیل که به صورت خودکار توسط دستگاه محاسبه میشود، انجام گرفت [67]:
(3-10)

در این رابطه، R بیان کمی ژن و CT شماره سیکل آستانه تشخیص نور فلورسنت توسط دستگاه است که با میزان cDNA هدف همبستگی منفی دارد. یعنی هرچه میزان ژن هدف بیشتر باشد تعداد سیکل لازم برای رسیدن به حد آستانه تشخیص توسط دستگاه کاهش مییابد. Sample نمونه مورد آزمایش و Calibrator نمونهای است که بیان ژن مورد نظر در نمونه نسبت آن توصیف میشود. در این مطالعه، نمونه شماره 4 از ایستگاه چشمهدیمه با جنسیت ماده به عنوان نمونه کالیبراتور انتخاب شد. معیار این انتخاب، جنسیت ماده و بنابراین اطمینان از وجود mRNA ویتلوژنین، بالا بودن غلظت RNA و داشتن RIN مناسب بود. منظور از Housekeeping gene، ژن کنترل داخلی است. این ژنها، کدکننده پروتئینهای لازم برای عملکردهای اساسی سلول هستند که معمولاً در بافتهای مختلف به یک میزان بیان میشوند. شرط اصلی و لازم در انتخاب این ژن، ثابت بودن میزان بیان آن تحت شرایط آزمایش است. در این مطالعه، ژن بتا-اکتین به عنوان ژن کنترل داخلی انتخاب شد.
جدول 3-2) اولیگونوکلئوتیدهای طراحی شده برای حصول قطعات مورد نظر و آنالیز QPCR در ویتلوژنین و بتا-اکتین.
آغازگر جهت توالی (5’-3’) موقعیت
تکثیر قطعات حدواسط slVTG-Fمستقیم GACMSARAACACCTTYMTGATG 203 a
slVTG-F مستقیم TGACCAGCATTGCCCAKAAC 1480 a
slβactin-F مستقیم ACCACAGCYGARMGKGAAAT 699 b

Related posts: